基因工程乳酸菌作为活载体表达外源蛋白及疾病防治研究进展

刘 琼，陈宏亮，姜延龙，王春凤

(1.吉林工程技术师范学院食品工程学院，吉林长春130052；2.吉林农业大学动物科学技术学院 吉林省动物微生态制剂工程研究中心 教育部动物生产和产品质量安全重点实验室，吉林长春130118

乳酸菌是一类可以发酵碳水化合物产生乳酸的兼性厌氧菌总称，包括乳球菌、乳杆菌、链球菌、片球菌和双歧杆菌等，美国食品和药品监督管理局(FDA)将许多乳酸菌定义为“食品级”微生物，极少数如化脓性链球菌，肺炎链球菌是致病菌。乳酸菌可以调节肠道菌群组成从而维持肠道稳态，提高免疫力；还可竞争型地占位，定殖在肠道表面诱导黏膜液以及肠道上皮细胞抗菌肽(AMP)的产生[1]；在治疗消化系统疾病(病毒性及细菌性腹泻)、炎症性肠病(IBD)和自身免疫性疾病中发挥了至关重要的作用。工程化的乳酸杆菌以其可食性，遗传操作技术成熟简便，效率高，重复性好等特点非常适合作为外源蛋白或药物的递呈工具。因此，利用基因工程乳酸菌递呈抗原蛋白，无论在体外发酵还是在体内表达，都具有其他工程菌株无法比拟优势，使其成为新型活载体用于多种病原微生物抗原及生物活性分子的表达，成为防治人及动物疾病的理想选择。

1 基因工程乳酸菌载体/受体系统

1.1 基因工程乳酸乳球菌表达系统 乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)是典型模式菌，常用于食品发酵，抗原性弱，自身分泌蛋白较少，基本不在胃肠道内定植，早在21世纪初期，科研人员便开展了对乳球菌载体疫苗的研究。质粒消除菌株LactococcuslactisIL1403、LactococcuslactisMG136是最常用的宿主菌，基因组序列已经测出。随着具有广泛宿主范围的乳酸菌复制子发现，派生出低拷贝质粒pIL252和高拷贝质粒pIL253，在此基础上利用乳酸菌内源组成型或诱导型启动子构建出表达载体/受体系统，其中乳链球菌素表达系统(Nisin controlled expression,NICE)最常用，乳链球菌素Nisin具有抗微生物活性，它的生物合成受到NisK和NisR双组分调节系统控制，环境中存在Nisin时，Nisk可以识别Nisin，使NisR磷酸化从而激活NisA启动子，转录下游基因。近年来又出现的一些较为高效的诱导表达系统，如锌离子浓度调节的Zirex表达系统[2]、热应激蛋白基因groESL启动子所调控的压力诱导性表达系统(Stress inducible controlled expression，SICE)[3]。

1.2 乳酸乳杆菌表达系统 随着人们对乳杆菌的研究日益增多包括：鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌以及加氏乳杆菌等，乳杆菌属因为高基因多样性使表达载体的制备非常困难，只有在特定的菌株内才有适合的配套质粒复制系统。最常用的植物乳杆菌，嗜酸乳杆菌，加氏乳杆菌的质粒复制子分别为pWV01、pSH71和pAMbeta-1。乳杆菌质粒表达载体构成中既有组成型的启动子如磷酸甘油酸变位酶启动子Ppgm、乳酸脱氢酶启动子Pldhl和S层蛋白启动子PslpA，也有诱导型启动子。随着国内外对乳酸杆菌基因组的研究，已经鉴定出多种环境诱导型启动子，并应用于报告基因的表达，常见的是肠球菌热休克蛋白启动子，它的活性在植物乳杆菌中已得到检验[4]，以嗜酸乳杆菌为宿主的糖诱导表达系统如：低聚果糖启动子PFOS， 乳糖Plac和海藻糖 Ptre，还有pH值诱导表达系统、噬菌体诱导表达系统、温控诱导表达和清酒乳杆菌素诱导表达系统。

1.3 外源蛋白的定位表达 乳酸菌质粒表达载体可定向运输其表达的外源蛋白，根据蛋白与宿主菌的相对位置，将外源蛋白的表达情况分为胞内表达，胞外分泌表达及菌体表面锚定表达。乳酸菌作为活载体的免疫效果受到外源蛋白表达位置、免疫途径、免疫程序、受体菌株种属及抗原的表达量影响，尤其是抗原的表达量直接影响免疫水平和免疫类型。迄今为止，外源抗原蛋白在乳酸菌宿主细胞上的最有效定位还没有明确定论。大量的外源蛋白表达在胞内会使细胞致死或是抗原集中降解，而且在细胞内表达的外源抗原不能充分地与黏膜免疫系统接触而影响免疫应答效果是目前科研工作者亟待解决的一个主要问题。近期的研究结果证明，将外源蛋白锚定表达在宿主细胞表面是活载体疫苗向黏膜免疫系统提呈抗原的最有效方式，因此对乳酸菌锚定表达系统的深入研究对提高疫苗的效果具有重要的实践意义。

外源蛋白在菌体表面定位表达方面，本研究室的刘琼以pW425et为基础载体利用嗜酸乳杆菌S-层蛋白基因构建了锚定表达系统pW425et-S[5]，蔡若鹏将来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)聚-γ-谷氨酸合成酶A(Poly-γ-Glutamic Acid Synthetase A，pgsA)基因截短连接在诱导型表达载体pSIP409启动子之后，获得锚定表达载体pSIP409 pgsA′，该载体可将EGFP和IL-10锚定在植物乳杆菌表面[6]。在此研究基础上，2016年周芳玉[7]及2017年Jiang等人分别以锚定表达载体pSIP409pgsA 和pSIP409 pgsA′成功表达鸡柔嫩艾美耳球虫EtMIC2基因和禽流感病毒H9N2亚型HA2蛋白，获得的工程菌口服免疫雏鸡具有中等的抗球虫效果，锚定表达含有HA2蛋白和佐剂分子LTB的植物乳杆菌可以显著地提高免疫小鼠的抗禽流感病毒能力[8]。

1.4 载体的无抗性选择标记 区分细胞是否含有重组质粒要用选择标记进行筛选，行之有效且应用较多的是抗生素抗性标记，如红霉素、氯霉素等，但随着人们对食品安全的重视日益增强，抗性基因漂移将会给人类和环境带来严重的危害。经过几十年的研究，科学家们研究发现一系列代替抗的筛选标记，主要包括糖类、细菌素、营养互补、金属离子选择标记等。营养互补选择标记主要包括嘧啶和氨基酸营养互补选择标记。王春凤利用胸腺嘧啶核苷酸合成酶 (thyA)基因替代穿梭载体pW425e中的红霉素抗性基因，得到了以thyA为选择压力的非抗性质粒载体pW425t，达到非抗性筛选阳性重组体目的[9]。

2 基因工程乳酸菌作为活载体表达外源蛋白防治疾病的应用

2.1 抗病原微生物 大多数乳酸菌疫苗研究都集中在乳酸乳球菌，也有部分研究是关于植物乳杆菌，嗜酸乳杆菌，干酪乳杆菌以及枯草芽孢杆菌。其中，植物乳杆菌属的几种典型菌株，具有耐酸耐胆盐，在肠道内吸附和定殖的能力，同时竞争性地抑制病原微生物的定殖。与乳球菌相比，植物乳杆菌存在的最大问题是蛋白表达的水平偏低，蛋白表达低就不能引起足够强度的免疫反应，不能提供对疾病的有效保护。所以，为了提高抗原的表达浓度，设计组成型的启动子，便成为一种解决方案，S层蛋白slpA启动子就是一个很好的应用。李一经等，以乳酸乳球菌分泌表达型载体pPG612为基础载体，用短乳杆菌S层蛋白启动子slpA构建组成型表达载体，以猪传染性胃肠炎(TGEV)的N蛋白基因为目的基因检测slpA启动子在3种不同乳酸杆菌中表达能力，表明此启动子具有严格宿主选择性，在植物乳杆菌中活性最好、表达量最大，在重组干酪乳杆菌L393次之，在重组副干酪乳杆菌中最差[10]。

此外，将抗原和佐剂分子联合应用，也是一种增强疫苗效率的方法。2011年，Andersen等[11]用乳酸杆菌表达单链抗体，在胃肠道对炭疽杆菌毒素进行中和，产生免疫保护。2015年Katarzyna等利用人植物乳杆菌锚定表达HIV-1Gag派生抗原与趋化因子CCL3融合蛋白，体外实验使T细胞募集作用增强[12]。

在增强乳酸菌疫苗载体免疫效果的相关研究方面，本研究室Yang等将H9N2型禽流感病毒的保守抗原NP、M1与靶向树突状细胞诱导肽(DCpep)融合，重组到植物乳杆菌NC8中，表明NP-M1-DCpep的乳杆菌可以诱导强烈的细胞免疫应答与黏膜免疫应答，显著地提高黏膜sIgA与IgG的抗体水平，从而对抗H9N2型禽流感的感染[13]；Jiang等[14]将新城疫病毒(NDV)保护性抗原HN蛋白基因与DCpep相融合，用植物乳杆菌NC8为递送载体，发现重组菌能够显著提高雏鸡HI效价水平，诱导黏膜免疫应答，产生效应细胞，抵抗NDV的攻击。

2.2 抗IBD IBD病因尚不明确，主要表现为肠道炎症性紊乱，乳酸菌可以减轻肠道炎症，用乳酸菌治疗IBD具有独特的优势。此外，经口服途径进入机体的重组乳酸菌疫苗，引起黏膜与全身免疫应答，会增加IBD的防治效果。低钙V抗原、TNF-α纳米级抗体、三叶因子、过氧化氢酶和IL-10，都能够用乳酸乳球菌载体在患病动物模型体内成功地表达，通过口服给药的方式，黏膜水平上递送治疗性药物，是取得良好疗效的关键因素。可分泌IL-10的重组乳酸乳球菌活载体疫苗已经进行到药物临床试验阶段，用以治疗克罗恩病，但是从目前得到的临床结果来看，由于肠道内IL-10的浓度偏低，试验以失败而告终。所以，研究人员最近用乳酸菌表达IL-27，在抑制炎症的同时又可以诱导IL-10的表达[15]，在IBD小鼠模型中降低该病的发病率。弹性蛋白酶抑制剂，一种内源性蛋白酶抑制剂，在IBD患者体内，弹性蛋白的含量下降，而弹性蛋白在健康人肠道内发挥了抗炎的功效，分别用乳球菌和干酪乳杆菌载体表达此蛋白，在IBD模型小鼠体内进行评价结果发现可以降低弹性蛋白离解活性，缓解炎症[16]。

2.3 乳酸菌与糖尿病 针对Ⅱ型糖尿病的胰岛素替换疗法尚有不足，一是胰腺β细胞被自身免疫应答所损伤；二是注射胰岛素不能阻止并发症。因此，运用乳酸菌活载体治疗Ⅰ型与Ⅱ型糖尿病，是近几年采用的新免疫疗法。2011年Ng和Sarkar[17]发现，可分泌胰岛素类似物的重组乳酸乳球菌在体外实验可增强脂肪细胞的生物代谢功能。2014年，Agarwal等[18]通过基因工程乳酸乳球菌载体递送胰高血糖素样肽-1(GLP-1)，在Ⅱ型糖尿病大鼠模型体内完成评价，口服重组菌的给药方式，与注射GLP-1的给药方式相比，大鼠血糖水平下降，同时胰岛素含量升高，抗病机理还有待进一步研究。

Ⅰ型糖尿病是以自身反应性T细胞对胰岛β细胞进行性破坏为主要特征的自身免疫性疾病。胰岛素和胰岛素原是该病的重要抗原，胰岛素自身抗体在高风险病人体中广泛存在。针对Ⅰ型糖尿病，2014年Robert等利用重组前胰岛原谷氨酸脱羧酶GAD65370-575+IL10的乳球菌加上低剂量的抗 CD3 单克隆抗体联合治疗新诊断发病的NOD 小鼠取得了很好的效果[19]。2015年Robert等利用乳球菌将Ⅰ型糖尿病的两种主要抗原谷氨酸脱羧酶(GAD65)和酪氨酸磷酸酶样蛋白ICA512(IA-2)与IL-10共分泌表达，在糖尿病小鼠模型中得到了较好的治疗效果[20]。

2.4 抗癌症 癌症与人类健康密切相关，世界范围内癌症的发生率也在不断上升，利用乳酸菌来防治癌症是近年来出现的一种新的尝试。在直肠癌小鼠模型实验结果来看，双歧杆菌，干酪乳杆菌，长双歧杆菌，嗜酸乳杆菌，鼠李糖乳杆菌和费氏丙酸杆菌均呈现出明显的降低癌症发展功效。虽然体外和动物模型试验某些菌株表现出较好的抗癌效果，但目前还没有关于人的临床试验研究。

通过静脉注射的方式，某些食品级的乳酸菌进入动物机体后，可以抵达固体肿瘤的附近，并可以积聚和繁殖。这个现象可能与肿瘤内部的低氧环境有关，在这样的缺氧环境中，厌氧细菌就可以选择性地生长。于是，研究人员利用长双歧杆菌重组胞嘧啶脱氨酶，通过静脉注射去治疗乳腺癌。另一个应用是将内皮抑制素重组双歧杆菌，静脉注射给肿瘤小鼠模型，结果表明，重组菌可以选择性抑制血管生成和肿瘤生长。

近年来，研究人员尝试利用重组乳球菌表达16型人乳头状瘤病毒E7蛋白(HPV-16 E7)治疗宫颈癌，其中利用NICE表达系统表达重组E7蛋白在动物实验上的结果表明，重组菌可以引起肿瘤体积轻微减少和特异性免疫应答反应。Rangel-Colmenero等[21]将E7蛋白与钙网蛋白融合表达，发现对肿瘤的抑制率大于80%。在利用基因工程乳酸菌抗癌症方面，本研究室Hu等[22]从酸奶中分离得到鼠李糖乳杆菌与植物乳杆菌，植物乳杆菌能抑制小鼠结肠癌，他们还利用植物乳杆菌NC8重组新城疫病毒HN基因，检测重组乳酸菌对小鼠结肠癌的抑制作用，结果发现，重组菌通过促进NK细胞的增殖活化，诱导树突细胞的成熟，促进毒性T细胞的杀伤活性，发挥抗肿瘤的作用。

2.5 抗寄生虫病 利用基因工程乳酸菌活载体表达寄生虫的保护性抗原来防治寄生虫疾病，在解决寄生虫病疫苗防治困难的同时也可以减少药物的使用，降低动物性食品中药物残留，本研究室开展深入系统研究，Yang等[23]用植物乳杆菌载体NC8融合表达柔嫩艾美耳球虫SO7基因与DCpep串联，发现表达SO7- DCpep的重组菌可以有效地降低雏鸡盲肠病变，具有良好的保护效果；Yao等[24]利用植物乳杆菌载体NC8，表达金鱼小瓜虫抑动蛋白IAG-52X，发现重组菌可以引起金鱼血液与皮肤中抗体水平显著升高，IgM、补体和MHC-I类分子的表达量显著升高，金鱼的存活率也有所升高。

3 展望

目前利用基因工程乳酸菌已表达多种细菌、病毒抗原及生物活性分子[25]，动物试验表明，能够诱导机体产生免疫应答，从而增强动物抗病能力，达到预防和治疗疾病的目的。然而基因工程乳酸菌制剂在商品化之前还有许多需要解决的问题：(1)标记基因，用于构建基因工程乳酸菌的诸多载体无论是质粒载体还是染色体整合载体大部分还是以红霉素、氯霉素等抗生素为筛选标记，在实际应用时存在抗性基因的转移安全隐患，无抗性筛选标记是未来研究的主要方向；(2)宿主菌选择，乳酸菌具有较高的生物学与遗传基因型多样性，相同基因在不同宿主菌中表达水平也有所差异，刺激细胞引起的细胞免疫和体液免疫也不同，应根据研究目的不同而选择合适的宿主菌株；(3)免疫耐受，外源蛋白表达量低是乳酸菌作为表达系统的一个普遍问题，乳酸菌长期在消化道内表达的抗原蛋白能否引起机体免疫耐受，引起的免疫耐受如何解决也是未来研究的重要方向；(4)载体开发，乳酸菌已经实现多种外源蛋白的体外表达，但在肠道内蛋白的表达情况及生物活性仍无法准确检测，因此，需要开发新的表达系统将外源蛋白在乳酸菌中的表达准确定位，将抗原暴露实现对黏膜免疫系统的精准递呈；(5)免疫机理方面，尽管重组乳酸菌能够诱导产生特异的免疫应答，达到很好的免疫效果，但是不同种属的细胞壁成分不同，而有些细胞壁的组成恰好是模式识别受体TLR样受体或者NOD样受体在抗炎反应中识别的成分，乳酸菌在调节天然免疫通路，提高自身免疫的机理尚未阐述。乳酸菌作为宿主菌将外源蛋白锚定表达，是递呈抗原的最有效方式，因此如何提高蛋白锚定表达量及实现两种或3种外源蛋白同时锚定表达，并采用无抗性筛选标记对乳酸菌锚定表达系统深入研究，是未来乳酸菌作为载体递呈抗原的主要研究方向。随着分子生物学、基因功能和免疫机制更深入的研究，基因工程乳酸菌必将具有更广阔的应用前景。