伪狂犬病病毒致病机理与防控技术研究进展

路金金，王晓佳

(中国农业大学动物医学院，北京海淀100193)

猪伪狂犬病病毒(PRV)又称猪疱疹病毒I型、奥耶斯基氏病毒，具有嗜神经组织性，可导致新生仔猪致命性脑炎、生长育肥猪呼吸系统疾病和母猪繁殖障碍，给全球养猪业带来了严重的经济损失。PRV作为典型的疱疹病毒，常被用作基因治疗、肿瘤治疗，以及神经元电路示踪的研究工具或模型。PRV可感染多种动物，除了猪、牛、羊、犬和猫外，还有野生动物和肉食动物也易感染。2018年6月“华山战狼团队”暴出了PRV感染人的病例[1]，这震惊了国内外学者。于此同时，赵伟丽等将2016年12月至2017年12月间北京协和医院神经科的样品进行检测，确诊4例PRV病例，患者均是从事生猪及生猪肉产销的人员，其脑炎、视网膜炎等症状明显[2]。这提醒我们，PRV已跨越物种屏障而感染人类，对全球公共卫生造成严重威胁！人们必须重新认识PRV，提高防控意识，在危害扩大之前及时遏止该病毒的突变与传播速度。

流行病学调查表明，PRV及其变异株在我国多个省市广泛出现，且流行区域有扩大的趋势，给我国猪伪狂犬病的净化带来严峻挑战。本文从PRV流行病学、分子致病机理、疫苗与抗病毒制剂3个方面，将近几年的研究进展进行综述，为该疫病的综合防控提供科学资料与有效策略。

1 流行病学

PRV有广泛的宿主群，然而易感动物中只有猪是PRV的贮存宿主，各阶段的猪均可被感染，其中以两周龄的仔猪症状最为严重，死亡率高达100%。随年龄的增长，病死率逐渐下降，成年猪常呈隐性感染或潜伏感染，在外周神经系统终生携带该病毒，并将其传播给其他动物。PRV可通过呼吸道、消化道、垂直传播、配种、输精等途径直接传播，也可通过接触被病猪、带毒猪或其排泻物、流产胎儿等污染的用具、饲料、饮水等媒介物间接传播。不表现明显临床症状的隐形感染猪是猪场PRV暴发的重要因素，病猪、康复带毒猪和带毒鼠也是重要传染源。成熟PRV在感染其自然宿主猪的过程中，首先侵入猪表面黏膜的上皮细胞，之后进入神经纤维末梢，最后入侵外周神经节和中枢神经系统[3]。

猪伪狂犬病一年四季均可发生，较易发生在寒冷的春冬两季。1990-2011年间，经典疫苗株Bartha-K61(gE基因缺失苗)安全有效地控制了PRV在我国的传播。2011年下半年出现Bartha-K61株疫苗免疫过的猪群中暴发伪狂犬病的报道，研究发现PRV出现了变异，经典疫苗株不能再为其提供完全的保护，这给我国养猪业敲响了警钟。2013-2016年间有学者在山东省跟踪了395例临床案例和收集了5 033份猪血清样本。经检测395例样品中110例为PRV gE基因阳性，并从其中分离到了15种PRV变异株；收集的5 033份猪血清样本中，57.8%呈现PRV gE抗体阳性[4]，这表明PRV变异株在山东省猪场普遍存在。也有学者分析了2013-2016年间PRV变异株在我国各地繁育猪场的流行情况，发现PRV变异株阳性率在我国总趋势是逐渐下降的(从22.17%降至13.14%)，不同地区间有所差异[5]。PRV血清型单一，不断出现新的传播能力和毒性都增强的变异株，毒株间毒力和生物学特性差异明显。毋庸置疑，PRV变异问题需要被学界与业界充分关注，各大规模化猪场对伪狂犬病的控制与净化做出规划。

2 致病机理

PRV病毒属于疱疹病毒科，甲型疱疹病毒亚科，水痘病毒属，病毒呈圆形或椭圆形，直径为150～180 nm。PRV成熟的病毒颗粒由4种形态上不同的结构构成：包含着病毒线性双链DNA基因组的核仁、包裹着核仁的保护性二十面体核衣壳、由蛋白质基质形成的壳皮，以及包裹着壳皮并含有几种病毒糖蛋白的脂质膜构成的囊膜[6]。PRV基因组为线性双链DNA，长度约为150 kb，其中G+C平均含量达74%。2004年Klupp B G等完成了PRV基因组基因序列的测定[7]，极大地推进了学者们对PRV基因及蛋白功能的进一步研究。2006年Pomeranz L E 等统计，PRV基因组由72个阅读框组成，可编码70种蛋白质[8]。近年来对PRV病毒与宿主细胞的相互作用研究越加深入，为病毒致病机制的研究奠下扎实的基础。

2.1 基因组US/UL独特区域 疱疹病毒基因组分为6级，用字母A-F表示，PRV基因组同水痘带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)一样属于D类，特征在于存在长独特(Unique long,UL)与短独特(Unique short,US)区域，其中US区位于内部重复序列(IRS)和末端反向重复序列(TRS)两侧。UL和US线性排列长度分别为110 kb和9 kb，在基因组中与IRS和TRS共同形成UL-IRS-US-TRS的序列。早期的学者根据试验数据建立了良好的基因组图谱，将UL内不同的基因片段依次命名为UL1-UL54，将US内的基因依次命名为US1-US9。

疱疹病毒衣壳的出核由保守的核出口复合物(Nuclear egress complex,NEC)介导，其由膜锚定的pUL34及其核质相互作用配偶体pUL31组成。2014年Paßvogel L等鉴定出pUL34中两个天冬酰胺残基(N75,N103)和一个二亮氨酸基序(LL166 / 167)是维持NEC功能所必需的。pUL34-N75A突变体不能与pUL31相互作用，而pUL34-N103A突变体则失去功能[9]。Zhang R等研究表明pUL50不仅具有dUTP酶活性，还能通过促进IFN受体的降解而抑制Ⅰ型干扰素通路，从而有助于PRV逃脱宿主的免疫消除[10]。Zhao H等发现，pUL56和猪白细胞抗原1类分子相互作用可导致后者泛素化程度加强，也可能与免疫逃避有关[11]。Richards A L等发现，UL37表达的蛋白表面R2区有一种神经侵袭性效应器，该区域突变会导致PRV失去沿轴突逆向传播到动物外周神经节的能力[12]。Ye C等构建UL41缺失变异株，与野生型相比，该变异株体外的增殖能力和体内的神经侵袭性均受损[13]。这些发现为一种新型弱毒活疫苗的研发提供了方向。

2009年有学者提出US3表达蛋白pUS3激酶活性是肌动蛋白细胞骨架调整所必需的[14]，而pUS3激酶诱导的细胞骨架重排和细胞延伸，与病毒向周围细胞的扩散密切相关[15]。2015年Jacob T等进一步证明，pUS3表达可导致PKA依赖性RhoA 磷酸化，而这有助于pUS3诱导的肌动蛋白细胞骨架重排[16]。最近Lyu C等用猪大脑皮层原代培养系统培养US2缺失型PRV，发现与野生型PRV相比，病毒的滴度反而较高[17]。这为深入了解PRV致病机理提供新数据。

2.2 病毒编码miRNA 微小RNA(microRNA,miRNA)是一种含22～24个核苷酸的非编码单链RNA分子，主要参与转录后的基因调控，在所有植物和动物中都表达，包括DNA病毒。目前发现的病毒miRNA多来自疱疹病毒，这是由于疱疹病毒基因组较大，单个病毒就能编码出大量的miRNA(一些成员能表达超过30种miRNA前体)。这些miRNA通常成簇聚集在疱疹病毒基因组中，存在于潜伏相关转录物(Latency-associated transcript,LAT)基因座内或其附近。研究表明，LAT基因座中miRNA簇的缺失，会影响PRV在猪三叉神经节内建立潜伏期后引起的宿主应答[18]。最近发现，miRNA在疱疹病毒的感染中发挥着基因调控作用，miRNA簇与PRV病毒的复制与毒力密切相关[19]。

2.3 病毒糖蛋白 目前已有11种PRV糖蛋白被报道，分别为gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM和gN。2011年接种过PRV疫苗的猪群中暴发了高致病性伪狂犬病病毒变异株ZJ01的感染，其较强的毒力被证明与gE和gI的变异相关[20]。浆细胞样树突状细胞(pDC)在抗病毒免疫反应中起重要作用，这类细胞能够产生大量的I型干扰素(TI-IFN)。而Lamote J A等指出gE / gI糖蛋白复合物等够抑制pDC产生TI-IFN[21]。Tang Y D等构建了病毒基因gE、gI、gG、gN、gM、US2、US9、US3、早期蛋白0(EP0)分别缺失的突变病毒，发现糖蛋白gM突变体的病毒毒力明显下降[22]，表明gM对PRV的毒力至关重要。

PRV病毒入侵过程中，gD介导与宿主细胞表面的受体结合后，gH和gL形成异二聚体激活gB，从而促进病毒囊膜与宿主细胞膜融合。研究表明，gH的N末端多糖对gH的功能有显著的调节作用，但这种调节作用不是必需的[23]，而gH 的跨膜锚定结构域是gH发挥功能所必需的[24]。此外，Zhi-qing Yu等发现gB具有良好的免疫原性[25]，这为靶向gH与gB设计抗病毒阻断剂提供新资料。

2.4 宿主细胞应答 在PRV感染所引起的天然免疫应答中，I型干扰素及其受体依赖性免疫稳态调节是宿主防御所必需的，IFN-α/β受体缺乏会增加机体对PRV的易感性[26]。ISG15是一种天然免疫中刺激IFN产生的泛素样蛋白，参与IFN-β介导的天然免疫应答，然而PRV可通过干扰猪体内ISG15的表达来抵制其介导的抗病毒作用[27]。同时，PRV感染细胞后能诱导细胞自噬水平增加，其程度与病毒的毒力成正相关，表明自噬对于病毒复制非常重要[28]。此外，毒性PRV感染机体能发生特异性的全身性炎性反应，这种炎性反应可导致小鼠死亡[29]。核苷酸内焦磷酸磷酸二酯酶(Ectonucleotide pyrophosphotase/ phosphodiesterase,ENPP1)与GMP-AMP循环合酶(Cyclic GMP-AMP [cGAMP)] synthase,cGAS)协同作用维持cGAMP含量的稳定并参与PRV的感染。感染PRV的细胞中，NEPP1过量表达则PRV的感染程度增强，提示其是重要的病毒作用靶位[30]。这些进展为进一步揭示该疫病致病机理提供了新思路。

3 PRV新型防控技术进展

3.1 新型疫苗 疫苗免疫接种仍是我国控制PRV发生的首选措施。1970年我国从匈牙利引入伪狂犬病疫苗Bartha-K61株，自1990年国内广泛使用该疫苗以来，我国猪伪狂犬病得到了有效的控制。然而，2011年后半年，PRV变异株开始大范围地出现。Bartha-K61株属基因型Ⅰ型，而近几年我国流行的PRV变异株形成了另一个独立的基因型分支即基因型Ⅱ型，我国的经典疫苗株已不能再为其提供完全的保护。新型PRV疫苗的研究在我国紧密展开。2016年Wang J等用PRV AH02LA株构建gE基因缺失的PRV LA-LB感染克隆，将其辅以佐剂制备成灭活疫苗免疫3周龄的PRV阴性仔猪。结果表明，在PRV攻毒后，该灭活疫苗不仅能明显减少病毒脱落，且能提供完全的临床保护[31]。2017年Yin Y等利用同源DNA重组，在PRV的变异株XJ株基础上去除gE/gI，构建了一个新的弱毒疫苗株rPRV XJ-delgI/gE-EGFP。用该弱毒疫苗免疫断奶仔猪，免疫后仔猪没有表现出任何临床症状，并在体内检测到了高水平的gB特异性抗体。28天后用PRV变异株FJ攻毒，除了轻微发烧外没有任何其他临床症状，而没有免疫该弱毒疫苗的仔猪出现典型的临床症状并在5天内全部死亡[32]。同年Jing D等进一步去除TK基因，构建TK/gE/gI三基因缺失苗。与双基因缺失苗相比，三基因缺失苗免疫猪具有较低的致病性和更高的保护力，是我国预防PR的理想候选疫苗株[33]。

此外，Liang C等还采用体外高温传代的方法，将PRV变异株JS-2012在Vero细胞中40 ℃条件下持续传代到第120代，获得PRV减毒株JS-2012-F120，该减毒苗免疫仔猪可保护仔猪免受经典毒株和新出现强变异毒株的攻击[34]。

3.2 抗病毒阻断剂 针对PRV的治疗，目前尚无特效药。在发病早期应用抗伪狂犬病病毒高免或丙种免疫球蛋白效果较好，但若已开始出现神经症状则效果不佳。目前国内外学者将PRV的新药开发提上日程，希望为紧急治疗提供资料。近年来研究表明，PRV在感染细胞的过程中能够借助DNA聚合酶辅助亚基UL42蛋白来进行细胞内定位，Changjie Lv等针对此机理发现伊维菌素通过靶向UL42蛋白核定位信号而具有抗PRV作用[35]。2014年魏子贡等人研发了一种抗PRV增殖的重组蛋白，可显著抑制病毒感染宿主细胞[36]。2017年Li X等针对gB鉴定出15中具有良好中和病毒活性的单克隆抗体，其中14种单抗靶向PRV gB的结构域IV并通过补体效应阻断病毒进入细胞；另1种单抗可识别gB结构域I，阻止病毒入侵且不依赖于补体作用[37]。2018年Zhao X等发现白藜芦醇能够抑制PRV的复制，减轻病毒感染引起的炎症，因此可明显降低PRV感染仔猪的死亡率，同时改善其生长性能[38]。天然产物具有抑制病毒复制、调节免疫反应等功效，靶向宿主细胞的抑制物亦可最大限度地减少耐药性可能。而多靶位抗病毒制剂的联用有望进一步安全、有效地发挥病毒防治效果。

4 展望与现状

随着对PRV研究的持续关注与推进，近年来伪狂犬病的综合防控取得了很大进展。新研制的TK/gE/gI三基因缺失苗有望成为候选疫苗株，多种新型抗病毒制剂的开发也成为该疫病紧急防控策略的重要组成部分。疫病检测方面，我国学者研究出双重液滴数字PCR (Duplex droplet digital PCR)与实时RPA检测方法(Real-time RPA)，前者具有良好的线性和可重复性，灵敏度较实时荧光定量PCR高16倍[39]；后者快速简便，在39 ℃下20 min即可完成PRV检测[40]。两种方法均有较高的准确性，且均能区分野毒株和gE缺失苗，为设定该疫病的防控策略提供了重要参考。然而，目前的形势也越发严峻，PRV变异株在我国多个省市广泛出现，毒力和传播能力也较Bartha-K61株有所增强；此外生产中常出现PRV与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型或大肠杆菌、副猪嗜血杆菌混合感染的情况。我国PRV的净化之路仍然任重道远！农业部在2017年3月的指导意见中，对伪狂犬病的防治提出了明确意见，要求我国所有国家核心种猪场必须在2020年前做到PRV阴性。及时遏止PRV的突变与传播速度，不仅需要基础病原学的快速发展，同样也依赖于规模化猪场精准的防控措施和合理的免疫程序。相信在学界和业界的一致努力以及紧密合作，我国伪狂犬病的净化道路一定会越走越稳。