唾液酸受体在大鼠肠黏膜微血管内皮细胞中的表达

唐玉玲，王昭华，霍彩云，郭晓桐，杨光辉，李颖鑫，王书扬，田海燕，胡艳欣

(中国农业大学动物医学院，北京海淀100193)

流感病毒属于正粘病毒科，流感病毒属，是有囊膜的单股负链RNA病毒。其中A型流感病毒感染可导致人类和动物严重的呼吸系统疾病，研究表明，高致病性A型流感病毒感染时，急性肺损伤并伴随严重的炎症反应是该病具有高死亡率的原因[1-2]。机体微循环系统遍布全身，微血管内皮细胞在微循环系统中起着最主要的保护作用，其中肠黏膜微血管内皮细胞在肠道中广泛分布，其是否可作为A型流感病毒感染的靶细胞，并借此经胃肠道进行感染，这些问题值得我们深入探究。本试验选取大鼠肠黏膜微血管内皮细胞，应用免疫荧光染色方法定性检测SAα2，3Gal和SAα2，6Gal受体的表达情况，并利用流式细胞术对两种受体进行定量分析，为进一步了解流感病毒能否经胃肠道感染的研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 细胞系 大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(RIM-MVECs)，由北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室惠赠。

1.2 主要试剂 多聚赖氨酸包被液：北京索莱宝科技有限公司产品；Triton X-100： Sigma-Aldrich 产品；浓硫酸：北京化工厂产品；PBS(磷酸盐缓冲液，pH值7.4)：北京迈晨科技有限公司产品；荧光素标记植物凝集素：Vector Laboratories产品；BSA：北京索莱宝科技有限公司产品；4%中性甲醛：北京化学剂厂产品；中性树胶：无锡江原实业技贸有限公司产品；DAPI： Roche产品；抗荧光淬灭剂：北京索莱宝科技有限公司产品。

1.3 大鼠肠黏膜微血管内皮细胞的培养 培养皿内加入10 mL含20%FBS的DMEM培养液，将细胞悬液吸出加入培养皿中，轻晃混匀复苏细胞。置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养，6 h后更换新鲜的DMEM培养液。观察培养皿中细胞的形态和密度，待细胞生长良好，密度约为90%时进行传代。

1.4 细胞爬片的制备 盖玻片用浓硫酸和无水乙醇分别浸泡处理后进行高压蒸汽灭菌，处理后的细胞爬片置于多聚赖氨酸工作液中浸泡，室温孵育10 min后取出，打开超净台紫外灯进行灭菌，展开晾干。0.25%胰蛋白酶消化细胞后，加入含20%FBS的DMEM培养液充分吹打，使之形成单细胞悬液。将处理好的细胞爬片放进24孔细胞培养板中，根据需要的细胞密度接种单细胞悬液，每孔加入500 μL单细胞悬液。将培养板置于5%CO2、37 ℃细胞培养箱中培养。

1.5 激光共聚焦定性检测细胞表面唾液酸受体 去除陈旧的细胞培养基，经固定、透化、封闭后，直接加入带荧光标记的抗体即荧光素标记的植物凝集素：FITC-MAA、FITC-SNA，室温下孵育2～6 h。用DAPI染核，中性树胶封片后在激光共聚焦显微镜下观察。

1.6 流式细胞术定量检测细胞表面唾液酸受体 0.25%胰蛋白酶消化细胞后，加入1 mL DMEM转移至1.5 mL离心管中，1 000 r/min(4 ℃)离心5 min。弃上清后加入1mL流式缓冲液漂洗1次，1 000 r/min(4 ℃)离心5 min。避光条件下，在离心管中加入200 μL稀释好的、带荧光标记的植物凝集素FITC-MAA或FITC-SNA，重悬细胞，4 ℃条件下避光孵育1 h。离心管中加入1 mL流式缓冲液漂洗细胞1次，1 000 r/min(4 ℃)离心5 min，去上清。加入200 μL流式缓冲液，重悬细胞，流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 大鼠肠黏膜微血管内皮细胞表面唾液酸受体的定性检测 大鼠肠黏膜微血管内皮细胞的免疫荧光染色结果，如中插彩版图1所示，SNA-FITC、MAA-FITC染色后均呈阳性(绿色)，肉眼观察SNA-FITC染色强度略高于MAA-FITC的染色强度。说明细胞表面既表达SAα2,6Gal又表达SAα2,3Gal，即同时表达人流感病毒受体和禽流感病毒受体，且受体表达量可能有所差异。

2.2 大鼠肠黏膜微血管内皮细胞表面唾液酸受体的定量检测 为了进一步定量分析大鼠肠黏膜微血管内皮细胞表面唾液酸受体的表达情况，按照本文1.6所示方法，分别用浓度为5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL的SNA-FITC或MAA-FITC孵育细胞，然后通过流式细胞仪进行定量分析。结果如中插彩版图2所示，当浓度为5 μg/mL时，MAA-FITC(SAα2,3Gal)染色阳性细胞占70.5%，SNA-FITC(SAα2,6Gal)染色阳性细胞占98%；当使用更高浓度(10 μg/mL和20 μg/mL)进行孵育时，MAA-FITC和SNA-FITC染色阳性细胞均高于95%。平均荧光强度(Mean fluorescence intensity, MFI)随着使用植物凝集素浓度的提高而提高，存在一定的浓度依赖性，当浓度为5 μg/mL时，SNA-FITC的平均荧光强度为MAA-FITC的9.49倍，浓度为10 μg/mL 时为11.83倍，浓度为20 μg/mL时为12.14倍。上述结果与我们在激光共聚焦中肉眼观察到的结果一致，即SNA-FITC染色强度高于MAA-FITC，说明大鼠肠黏膜微血管内皮细胞表面SAa2,6Gal表达量高于SAa2,3Gal 的表达量。

3 讨论

现阶段科学研究表明，流感病毒感染宿主细胞的第一步是流感病毒表面的抗原决定簇血凝素蛋白与宿主细胞表面的唾液酸受体结合[3]。流感病毒的受体主要分为两种：唾液酸α2,3半乳糖受体，其广泛存在于人类的下呼吸道及禽类胃肠道，被认为主要被禽流感病毒识别；唾液酸α2,6半乳糖受体，被认为主要被人流感病毒识别[4]。唾液酸受体的种类和分布对于流感病毒的宿主范围和发病机制的研究至关重要[5]。A型流感病毒通常是通过呼吸道感染哺乳动物，然而有相关报道，通过消化道感染流感病毒时见发生[6]。本试验以大鼠的肠黏膜微血管内皮细胞为模型，证明了肠道细胞表面含有唾液酸受体，且SAa2,6Gal含量高于SAa2,3Gal 含量，提示肠道细胞可能更易感染人流感病毒。

微血管内皮细胞是位于循环血液与组织液之间的单层扁平上皮细胞，不但构成微血管通透性的物理屏障，而且作为一种多功能分泌细胞，能够合成和释放多种细胞因子，通过多种途径参与调解机体免疫反应。微血管内皮细胞意义重大，在维持血管壁的完整性、调节血管张力、血小板活化和聚集及血管壁重塑等方面具有重要作用[7]。微血管内皮细胞的完整性被破坏，势必会引起机体分泌功能失调，从而引发多种病理过程[8-9]。

有研究表明，高致病性禽流感病毒H5N1可通过肠道感染哺乳动物，病毒通过血管系统的全身传播导致的广泛性出血与内皮细胞和淋巴内皮细胞的大量感染有关[6]，这类似于禽类感染高致病性禽流感病毒的发病机制。而经呼吸道感染引起的全身性疾病的发病机制则正相反，病灶主要以坏死和炎症为特征，与实质细胞而非内皮细胞中存在的流感病毒抗原有关。病毒从肠道进入后明显的内皮趋向性提示高致病性H5N1流感病毒的表型具有高可塑性，哺乳动物系统性流感病毒感染的发病机制可能因侵染的入口不同而有差异。本试验结果也为流感病毒的内皮细胞趋向性提供了基础数据支持。内皮细胞在流感病毒感染中可能起着至关重要的作用，或存在重要的感染机制，本试验的结果可为深入探究流感病毒通过肠道屏障经肠上皮细胞或通过血管系统经血管内皮细胞等不同途径的传播机制提供基础数据。