牛蛙全身血管铸型及骨骼透明标本的制作

陈 锋，吴邹平，郭菁菁，吕婧薇，郑宇彬，杨为祝，王思宇，李长征

(福建中医药大学中西医结合学院，福建福州350122)

铸型透明标本是往血管内注入某种物质，待硬化后将组织用物理和化学的方法使软组织和透明剂的折光率相近，达到软组织透明，使骨骼和铸型枝被显现[1]。此技术的运用可以为两栖类动物血液循环的标本制作提供直观的全身血管形态学结构，对两栖类动物血液循环研究提供新的模型；对了解牛蛙全身血管和骨骼器官的分布情况，改进医学动物试验方法具有促进作用；在动物标本制作方面为鼠、蛇和鱼等其他小型动物铸型透明标本的制作提供新的思路；在标本应用方面为科研人员对于动物学的器官、骨骼和血管研究、比较解剖学的研究提供直观的形态学依据。目前关于骨骼透明血管铸型已有报道，但是基本多见于某个器官，小型动物全身标本制作较少，难度较高[2-4]。本方法使用不同的透明方式，调整了填充剂浓度，提高了成功率，制作出的标本效果良好，报告如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料 来自福建地区健康成年的牛蛙10只，体重(0.25±0.05)kg，不分雌雄。15%过氯乙烯填充剂、无水乙醇、10%甲醛、尿素透明液(尿素240 g、10%甘油1 000 mL、Triton X-100 10 mL)、茜素红、过氧化氢溶液、任氏液、20 mL塑料注射器、玻璃插管、止血钳、持针器、镊子、组织剪、烧杯、玻璃棒、量筒、玻璃缸若干等。

1.2 试验方法 用镊子夹取一浸透无水酒精的棉球,塞入牛蛙口腔中,待牛蛙全身肌肉松弛，眼睑角膜反射消失；打开胸腹腔，剪开下腔静脉放血，再打开心包，暴露心脏，剪开心室，在动脉干分叉处前插管结扎，然后用任氏液进行冲洗残余血液与凝块；将注射器上端连接在玻璃插管上，用力抽取直至不能抽动为止，然后用止血钳夹住橡胶插管，以防空气进入管道里面；向其注入配制好的15%过氯乙烯填充剂，见四肢末端有填充剂则停止灌注，每隔1～2 h补注1次，1～3次即可。

去除牛蛙皮肤，将其放入配好的10%甲醛固定(标本体积5～10倍)，固定1周左右；固定后的标本用流水冲洗5 h,过氧化氢漂白6～12 h(中途需更换)，清水冲洗6 h去除残余过氧化氢，将标本依次浸泡在配置好的80%、90%、100%酒精溶液中脱水各1周左右。

标本放入尿素透明液中，半个月左右，见肌肉呈半透明状态，骨骼隐约可见，即停止初步透明；预透明结束后，将标本浸入0.01%茜素红染液中2～3 d，见骨骼染上紫红色为止；用水洗去表面浮色，将标本浸入50%甘油溶液中，直到肌肉颜色褪为淡红色为止，之后分别放入60%、70%、80%、90%甘油中各1周，待充分透明后浸入纯甘油中保存。

2 结果

制作出的牛蛙标本肌肉和软组织呈淡黄色胶冻状，全身血管清晰可见，骨骼完整且呈玫瑰红色。所显示的牛蛙头骨、四肢骨和脊柱骨颜色清晰均匀，易于识别(见中插彩版图1)；牛蛙头部、脊柱区肩胛骨和四肢骨的血管(见中插彩版图1和2)以及腹腔内胃、肠的血管(见中插彩版图3)清晰可见；从整体上能充分显现骨骼系统和脉管系统在体内的自然分布情况及毗邻关系。

3 讨论

试验的注意事项：首先，本试验中所选的牛蛙需满足发育成熟、大小适中，太小不利于血管铸型，太大不利于后期骨骼染色透明；其次，试验过程中，牛蛙在失去生命体征后半个小时内进行灌注最佳，若放置时间过长，易凝血，导致细小血管堵塞，影响灌注及透明效果；再次，灌注前需充分排血，用任氏液进行冲洗，可以保证蛙心的持续跳动；从次，血管灌注过程中，用力要均匀缓慢，若力度过大，管道内压力过大，易导致主动脉弓破裂使灌注失败，因此需仔细感受压力并时刻观察牛蛙四肢及背部细小血管的灌注程度；最后，透明过程中需时刻保持警惕，否则将导致整个试验失败，如漂白时要注意观察标本的漂白程度，见肌肉上颜色基本脱掉即可，太过容易使细小铸型枝褪色，肌肉间产生大量气泡等问题。

试验的改进创新：在透明剂的选择上 以往的研究多选择二甲苯和氢氧化钾为透明剂，其中二甲苯透明效果显著，但存在使组织收缩、变脆和硬化，影响透明效果等问题[5]，且二甲苯是一种强致癌物，对试验者生命健康有潜在的威胁，气体挥发到空气中会对周围环境造成污染；氢氧化钾虽无毒无害，但在透明的时间和浓度上很难把握，很容易造成标本的损坏且透明效果不稳定；本试验选择无毒并具有一定溶解蛋白质作用的尿素和细胞破膜剂Triton X-100[6]，两者对组织的作用使甘油更易渗透，从而提高组织的透明度，透明后的组织呈胶冻状，标本形态完整，利于保存，且透明效果稳定可靠，能极大提高透明标本的成功率。

在填充剂浓度的选择上,选择过氯乙烯溶剂作为填充剂，其原理为溶剂挥发后凝固成型，此类填充剂收缩率大,流动性好,适合灌注流程较长的微细血管。以往的研究多集中于哺乳动物的血管灌注，多采用20%～25%过氯乙烯填充剂，以充分保证铸型枝的饱满。而牛蛙血管微细，其管径、弹性和厚度都不如哺乳动物。因此，填充剂的浓度应小于20%，经试验发现，选用浓度为15%过氯乙烯填充剂最为适宜。在该浓度下，灌注不会因管内压力过大而导致填充剂无法到达末端血管；也不会因填充剂浓度过低，挥发性过高，铸型支无法完好显现。

在试验对象的选择上 由于哺乳动物的体型相对较大，血管较粗、弹性较好、易于灌注，所以传统上制作铸型标本时多采用哺乳动物作试验对象，然而全身血管铸型及骨骼透明标本制作的报道仅见于胎儿，因哺乳动物胎儿期标本的不易获取，使其成为此类标本制作鲜有报道的一个关键原因。而本次研究另辟蹊径，选择材料易找，难度大、技术要求高、成功率低的两栖类动物-牛蛙作为对象，因其在全国各地的医学院和动物科学院的动物试验中应用广泛，有广阔的市场应用前景。

牛蛙全身动脉血管铸型透明标本的意义：(1)教学和科研方面 牛蛙作为两栖恒温动物，与人体在一定程度上有所相似，因而在众多生物试验上被选作试验对象，然而在教学过程中，学生仅通过课堂讲解和教学视频来熟悉操作流程且无法直观的了解牛蛙的解剖学构造及重要脏器,在试验过程中的盲目操作，导致判断不出相应的解剖部位，极易伤及血管，致使试验失败，从而达不到试验预期效果。目前已有的教学实验标本-浸制标本、骨骼标本和剥制标本等都存在着一定的不足，它们不但破坏了牛蛙的外形，而且不能很好的展示牛蛙血管和骨骼的位置关系。利用牛蛙全身动脉血管铸型透明标本，可以多维度的观察血管的形态、走行以及血管与周围肌肉、骨骼和器官的关系。在教学过程中，可以通过对标本的观察，让学生有直观立体的感性认识，加深对牛蛙内部器官结构的印象，提高教学试验的成功率，减少试验的耗材。通过该标本的制作也可以为科研人员对于动物学的器官、骨骼和血管研究、比较解剖学的研究、两栖动物生理、生态的研究提供直观的形态学依据。(2)养殖方面 随着牛蛙养殖规模的不断扩大，各种疾病问题相继出现，对牛蛙养殖技术中疾病的早发现、早诊断、早治疗提出了更高的要求。牛蛙全身血管铸型透明标本在牛蛙解剖的诊断治疗中发挥了重要的指导作用。