基于非线性化学指纹图谱法的牛羊乳混掺检测

樊 成, 缑敬轩, 刘 义, 董文宾

(1.陕西省产品质量监督检验研究院， 陕西 西安 710048； 2.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

近年来，羊乳因其独特的风味和营养价值以及作为牛乳不耐受替代物的功能被人们接受，因而受到消费者的青睐.但是由于羊乳的泌乳期受季节性的波动影响较大，使得产乳量不如牛乳，故价格远远高于牛乳而且供不应求[1].为牟取暴利，在羊乳中掺杂使假现象不断发生，尤其是在羊乳中掺入牛乳，因两种乳的成分及形态相似性大，普通理化分析方法无法发现其差异，因而是亟待解决的一个质量问题[2].

目前常用于定量检测牛羊乳混合二元乳的方法都是以牛羊乳中蛋白质、脂肪、DNA、维生素等为特征指标建立的[3]，检测方法主要有电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点聚焦电泳和毛细管电泳等)、高效液相色谱、质谱技术、酶联免疫技术和聚合酶链式反应技术等[2,4-6].但是鲜乳成分较复杂，由于品种、饲养条件、泌乳期等诸多因素的影响，各种成分的浓度在一定范围内波动，而不是固定不变的[1,7]，故单一乳成分的含量作为定量检测的依据具有一定的局限性.因此，有必要建立对乳及乳制品成分进行综合分析评价快速准确的检测方法.

非线性化学指纹图谱技术是根据化学振荡这种非平衡非线性化学现象的原理建立的一种鉴别与评价复杂样品质的新技术.化学振荡是化学反应系统的状态(各组分浓度、电极电势与扩散等)随时间周期变化的现象[8].目前在分析检测中最常用的是以Belousov-Zhabotinsky反应(简称B-Z反应)为基础的振荡体系[9].

在B-Z反应体系中加入样品后，会引起该体系在反应过程中电位和时间的信号关系，即E-t曲线的形状产生不同变化.这种形状特征不同的E-t曲线即为该样品的非线性化学指纹图谱(图1).非线性化学指纹图谱中不仅有直观的信息，比如波峰形状、诱导曲线、波动曲线和停波曲线等，还含有许多特征参数，包括峰谷时间(tcan)、峰谷电位(Ecan)、峰顶时间(tpet)、峰顶电位(Epet)、诱导时间(tind)、起波电位(Euns)、停波时间(Tune)、停波电位(Eune)、平衡时间(tequ)、平衡电位(Eequ)、最大波幅(ΔEmax)、波动周期(Tund)、波动寿命(tund)和波峰数目(nwav)等[10].依据这些参数的改变量与被分析物质浓度的关系，即可实现对被测物的定性定量分析[11-13].

图1 非线性化学指纹图谱模式图

对于中药及食品等成分复杂的样品，其非线性化学指纹图谱是样品中所有成分共同作用的结果，同其他测定样品中单一成分的检测方法相比，具有整体、宏观和模糊分析的特点，适用于鉴别样品真伪[14,15].而且该方法不需要复杂的样品预处理和提取纯化等步骤，因此该技术在食品和药品检测等领域的研究发展迅速[16-21].对乳品行业长期存在的羊乳中掺杂牛乳或马乳等其他异源乳这个难题的解决也同样取得显著的进展.王二丹等[22]发现牛乳和羊乳的二元混合乳的非线性化学指纹图谱参数之一诱导时间与二元乳中牛乳的含量呈良好的线性关系，并建立了两者之间的线性回归方程，该方程可用于定量测定牛乳浓度.马永杰等[23]则利用停波时间相对于羊乳粉中掺杂牛乳粉之间的一元线性关系，通过最小二乘法建立了反应停波时间和牛乳粉含量之间关系的数学模型，据此可定量测定牛羊乳粉中牛乳粉的含量.

但是非线性化学指纹图谱中其他参数是否可用于牛羊二元乳(粉)的检测，或者是否还有更理想的参数尚不确定.

同其他检测方法相比，非线性化学指纹图谱检测技术定量检测的优点在于该图谱是样品中所有成分共同作用的结果，因此理想的用于定量检测二元乳中不同来源乳的参数应该同尽可能多的乳成分具有相关性，但目前指纹图谱各个参数与鲜乳不同成分之间的相关性研究尚未见报道，故本研究将从非线性化学指纹图谱诸多参数中筛选有效的能够反映牛羊混合乳浓度变化的参数，并考察该参数与乳不同成分的相关性，建立更加灵敏可靠的混合乳定性定量检测方法.

1 材料与方法

1.1 材料

牛乳样品购自陕西科技大学附近养殖场及超市.羊乳样品购自三原兴牧乳山羊养殖专业合作社及附近农户.经感官评定、乳成分分析仪检测和滴定分析，感官指标及蛋白质、脂肪、非脂乳固形物含量和酸度等理化指标符合国标GB19301-2010《生乳》要求的牛乳及羊乳样品分别为33份和32份.

1.2 主要试剂

硫酸，天津市红碧化学试剂厂；溴酸钠，广州省化学试剂工程技术研究开发中心；丙酮，天津利安隆博华医药化学有限公司；硫酸锰，天津市福晨化学试剂厂.以上试剂均为分析纯，水为重蒸蒸馏水.

1.3 主要仪器

MZ-1B型非线性化学指纹图谱分析仪,湖南尚泰科技有限公司;217型复合甘汞电极、213型金属铂电极及MT-100型乳成分测定仪，南京南分医疗生化仪器有限责任公司.

1.4 实验方法

(1)测定方法

非线性化学指纹图谱测定方法：同马永杰[23].

乳成分测定方法：参照MT-100型乳成分测定仪说明书.

(2)分析方法

使用SPSS数据处理软件，通过单因素方差分析，筛选出牛羊乳之间具有显著差异的非线性化学指纹图谱参数；通过Pearson相关性分析确定指纹图谱参数与各种主要乳成分的相关性，通过回归分析法确定该参数与牛羊混合二元乳含量比的数学表达式.

2 结果与讨论

2.1 牛羊乳非线性指纹图谱比较

非线性化学指纹图谱有很强的特征性，不同品种的样品都有各自不同的图谱.羊乳和牛乳虽然主要成分相似，但是这些成分的种类和浓度仍有一定的差异，因此其非线性化学指纹图谱虽然相似但也有一定的差异.图2为随机抽取的两份牛乳和羊乳样品的非线性化学指纹图谱.从图2可以直观地看出牛乳与羊乳的指纹图谱基本形状相似，但是牛乳的诱导时间明显比羊乳的短，在振荡结束的后期，羊乳振荡衰减的更快，因此图谱的尾部相对牛乳要粗短，而牛乳图谱的尾部相对要细长.

图2 牛乳和羊乳非线性化学指纹图谱比较

这些直观的差异虽不能直接用于两种乳的定量检测，但是说明两种指纹图谱的某些参数是具有差异的.只有在两种乳中具有差异的非线性指纹图谱参数才可能用于检测牛羊二元乳(粉)中两种乳的含量，并且差异显著的参数更易于检测.故本研究首先筛选两种乳的图谱中具有差异的参数.在测定65个牛羊乳样品的非线性化学指纹图谱基础上，通过单因素方差分析比较牛乳和羊乳指纹图谱各参数的差异显著性，结果表明牛乳和羊乳指纹图谱的诱导时间、最高电位时间具有极其显著的差异，停波时间和最大振幅具有显著差异，而其他参数差异不显著，详见表1所示.

王二丹等[22]和马永杰等[23]分别发现诱导时间和停波时间与羊乳(粉)中掺入牛乳(粉)的含量具有线性关系，并确定了可用于定量测定羊乳(粉)中掺入的牛乳(粉)的含量的线性回归方程.本研究发现牛乳和羊乳的诱导时间和停波电位分别具有极其显著和显著的差异.因为两者具有显著的差异，因此当牛羊混合乳的混合比例发生变化时，该参数的改变才能够很好的反映这种含量的变化.

故本实验也从另一个角度验证了通过诱导时间和停波时间的变化测定牛羊二元混合乳中比例变化的合理性.另外牛乳和羊乳指纹图谱的最高时间和最大振幅分别具有极其显著和显著的差异，因此推测根据这两个参数的变化也可以测定牛羊混合乳中两者的含量.由于诱导时间和最高电位比停振时间和最大振幅的差异更显著，推测这两个参数用于两种乳含量的检测会更加准确可靠.

表1 牛羊乳非线性化学指纹图谱参数的单因素方差分析

注：*表示差异显著(0.01

2.2 羊乳成分与最高电位时间的相关性分析

由于纯羊乳和纯牛乳指纹图谱的最高电位时间和诱导时间均具有极其显著的差异，因此本研究进一步考察了这两个参数与羊乳主要成分的相关性.通过测定32份羊乳样品的主要成分，即蛋白质、脂肪及非脂乳固形物的含量以及指纹图谱的参数，利用SPSS统计软件中Pearson相关性分析考察乳成分与指纹图谱参数的相关性.结果如表2和表3所示.

表2 最高电位时间与羊乳成分的Pearson相关性分析

注：** P<0.01，极显著相关.

表3 诱导时间与羊乳成分的Pearson相关性分析

注：*0.01

Pearson相关性分析表明最高电位时间与蛋白质、脂肪和非脂乳固形物含量的r值分别为-0.5,0.504和-0.461，故三种主要成分与最高电位时间均具有中等强度的相关性，其中蛋白质和非脂乳固形物与最高电位时间为负相关而脂肪与最高电位时间为正相关，且在0.01水平上具有极其显著相关性.而另一个差异极其显著的参数诱导时间与蛋白质、脂肪和非脂乳固形物等也有显著的相关性，但相关性的强度(r值)和显著性(P值)均弱于最高电位时间.结果表明最高电位时间是可用于定量测定牛羊二元乳含量的最佳参数.

2.3 最高电位时间与两种乳含量的关系

由于纯羊乳和纯牛乳的最高电位时间具有极其显著的差异，并且该参数与羊乳中的三种主要成分均具有相关性，因此进一步考察不同含量比例的牛羊二元乳的最高电位时间.分别将最高电位时间最高和最低的牛奶27号和19号、羊奶11号和16号等质量混合，作为测试用纯牛奶和纯羊奶，分别配制牛乳含量([Mc])与羊乳含量([Mg])的比值([Mc]/[Mg])依次为1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1共9种含量不同的二元混合奶，并测定其最高电位时间，平行测定三次，取平均值.以[Mc]/[Mg]为横坐标，最高电位时间为纵坐标，做散点图，如图3所示.由图3可见最高电位时间随牛奶含量的增加逐渐降低，即随羊奶含量的增加，最高电位时间在延长.但[Mc]/[Mg]与最高电位时间并未呈现线性关系，非线性回归分析表明[Mc]/[Mg]与最高电位时间具有很好的对数对应关系，所得相关指数R2值最高的回归方程为：

tpet=-2.379ln[Mc]/[Mg]+12.258，对应的R2为0.967 2.

图3 牛羊二元乳中[Mc]/[Mg]与最高电位时间的回归分析

为验证回归方程的精密度和准确度，从样品中抽取牛乳及羊乳各一份，配制不同比例二元混合乳，并对比其最高电位的测量时间与和经验公式拟合时间，结果如表4所示.由表4可知，该方法测得最高电位时间的平均相对标准偏差为1.39，最高相对标准偏差<2.1，平均相对误差为6.65.以上结果表明该方法重复性好，不过相对误差略偏大，但是能够满足一般的定性和定量测定需要.

表4 非线性指纹图谱法测定

注：*平行测定5次，取平均值.

3 结论

为更好地利用非线性化学指纹图谱技术测定牛羊乳二元混合乳中两者的混合比例，本研究首次通过统计学分析方法从鲜乳的非线性化学指纹图谱诸多参数中筛选出牛羊乳之间具有差异的参数指标四项，其中停振时间和最大振幅具有显著差异(0.01

Pearson相关性分析表明最高电位时间与羊乳主要成分即蛋白质、脂肪和非脂乳固形物含量均具有相关性，且该相关性在统计学上具有极其显著的意义，因此混合乳中两种乳源的蛋白质、脂肪和非脂乳固形物的含量变化均能影响混合乳指纹图谱中最高电位时间的变化，故可以采用最高电位时间表征混合乳中牛羊乳的含量.最高电位时间随牛乳含量增加逐渐减少，而且牛羊乳含量的比值与最高电位时间具有很好的对数对应关系，所得回归方程和R2分别为tpet=-2.397ln[Mc]/[Mg]+12.258和0.967 2.经检验该方程合理可靠，可用于牛羊混合二元奶的定性和定量检测.

本研究建立了根据非线性化学指纹图谱最高电位时间确定牛羊混合二元乳中两种乳含量的方法，该方法具有操作简单、样品不用预处理和分析成本低廉的优点，为乳品掺假提供了一个简便可行的方法.