牛传染性鼻气管炎基因工程疫苗研究进展

杨 姣，陈 曦，陈颖钰,3，郭爱珍,3*

(1.华中农业大学 动物医学院，湖北 武汉430070；2.农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉430070；3.湖北省兽医流行病学国际科技合作基地，湖北武汉430070)

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)是由IBR 病毒(IBRV)又称牛疱疹病毒Ⅰ型(Bovine herpes virus type 1，BoHV-1)引起的一种急性、热性、接触性传染病，又称“红鼻病”或“坏死性鼻炎”，是牛呼吸道疾病综合征(Bovine respiratory disease complex，BRDC)和“运输热”(Shipping fever)的重要病原之一。IBR 最早见于上世纪50 年代美国科罗拉多州，由Madin 等人从患病牛中分离得到[1]。我国最早于1980 年从新西兰进口的一批牛中分离到该病毒[2]，随后发现此病的流行呈上升趋势，不同品种的牛均有感染，血清阳性率可高达70 %以上[3]。

BoHV-1 主要潜伏在三叉神经节中，在不同应激因素刺激下不定期被激活，导致牛再次发病。同时，由于该病毒具有免疫抑制作用，常引起继发感染或混合感染，加剧病情。目前国际上净化该病用了两种策略，如挪威、瑞士、丹麦等国已采用“检疫、捕杀”方法根除了该病，而德国、法国、美国等国家采用疫苗接种和检疫、捕杀相结合策略控制和净化该病。但整体来说，疫苗免疫是控制该病的有效手段。目前国内外市售的IBR 疫苗有灭活苗、减毒活疫苗和基因工程疫苗。后者代表IBR 疫苗发展方向，但不同种类疫苗的成熟度和应用程度差别很大。各类疫苗均有优缺点，但同时也共同面临一些关键技术问题。

1 基因缺失疫苗

基因缺失疫苗是利用分子生物学方法将病原体中某一个或多个复制非必需基因部分或完全缺失后制成的重组疫苗。其优点是病毒毒力不易返强，保持良好的免疫原性且安全性能高，缺失的基因可以作为一种检测标志用于免疫和野毒感染动物的鉴别。

复制非必需基因主要包括gB、gC、gE、tk，它们是构建基因缺失疫苗株的靶标基因[4]。tk 基因是BoHV-1 的主要毒力基因之一，研究表明，tk 基因的缺失大幅度降低该病毒的毒力而不影响病毒的复制，具有非常好的稳定性，该缺失株能够在牛体内存续3 个月，接种母牛后14 d之内产生中和抗体，与tk 阳性病毒株相比，前者可以减少排毒[5]，然而tk 基因缺失株并不能完全防止母畜流产。

gE 基因是病毒复制非必需基因，缺失后可以降低病毒力，其也是产生中和抗体的主要靶位点之一，可用于建立区分疫苗免疫和自然感染的鉴别诊断gE-ELISA 方法。BoHV-1 gE 基因缺失重组病毒的噬斑显著减小，其在MDBK 中的增殖不受影响，在牛体中产生的中和抗体滴度高于对照组，接种后42 d 其中和抗体滴度上升到16，并能显著增加IFN-γ 的产生，形成攻毒保护效力[6-7]。gE基因缺失疫苗既可以作为灭活苗，也可以作为弱毒苗。世界上很多国家利用gE 基因缺失疫苗来根除IBR，取得显著效果[8]。1995 年，gE 基因缺失标记疫苗研制成功，并在欧盟上市，由于其效果显著，gE 基因缺失标记疫苗在欧洲被广泛使用，此为第一代BoHV-1 基因缺失疫苗-gE基因缺失标记疫苗，爱尔兰和美国均有该相应商品化上市的疫苗。第二代BoHV-1 基因缺失疫苗gE-/tk-双基因缺失疫苗也在西班牙上市成为商用疫苗。配套使用的抗体检测试剂盒也已经商品化，如IDEXX (公司名)的IBR gE 抗体检测试剂盒等。

在此基础上，人们进一步研究双基因甚至多基因缺失突变株，以寻找免疫性能更好，毒力更弱的候选疫苗株，主要靶基因是毒力基因tk、gE 和与免疫逃避和抑制有关的基因gG、UL49.5 等。如在BoHV-1 Lam 株中缺失tk 和gE 基因，构建了BoHV-1 gE-/tk-双基因缺失突变株，牛体试验显示，该突变株接种牛后体温正常，未检测到排毒，在攻毒后1 周，BoHV-1 gE-/tk-诱导的中和抗体滴度较tk缺失株高10 倍以上[9]。该双基因缺失株已经在一些欧洲国家得到了使用，因为该疫苗缺失了tk 毒力基因，被认为是更安全的标记疫苗。此外，据报道，BoHV-1 gG-/tk-双基因缺失株安全性好，且能够诱导良好的免疫反应[10]。免疫抑制基因UL49.5 也是基因缺失的靶标位点，已经有研究表明，在受到感染时，细胞毒性T 细胞通过MHCⅠ类分子的抗原递呈作用来识别病毒感染，从而杀灭被感染的细胞，抗原与MHCⅠ类分子的结合发生在内质网，需要抗原加工转运蛋白(Transporter associated with antigen processing，TAP)将抗原从细胞质转移到内质网，而UL49.5 蛋白能够通过抑制TAP 的异构化和诱导TAP 的降解来组织抗原的递呈，从而形成免疫抑制[11]。动物实验结果也显示，缺失UL49.5 腔内残区30～32 个氨基酸后，缺失株能够诱导产生比亲本野生病毒株更高水平的中和抗体和IFN-γ 水平，且到达峰值时间分别提前了7 d 和14 d，CD8+T 细胞的增殖也提前了7 d，表明该缺失株诱导机体产生免疫反应的速度比野毒株快，缺失这些区域后病毒免疫抑制的功能受到了影响[12]。另外，Chowdhury 等构建了一个BoHV-1 三基因缺失突变株(缺失UL49.5 腔内残区30～32 个氨基酸以及胞质尾区80～96 个氨基酸、gE 胞质尾区和Us9 全基因)，并将其与gE 缺失疫苗做了比较。鼻腔接种牛后，二者均能够在鼻腔黏膜上皮细胞中复制，免疫牛不表现任何症状，4 周后攻毒，三基因缺失株能够诱导产生更高水平的中和抗体和细胞免疫应答，排毒时间较亲本株缩短了3 d，具有更高的保护效力[13]。表明免疫抑制基因的缺失可以较大提高疫苗的免疫效力，是未来疫苗研究的重要方向。

2 活载体疫苗

利用低致病力的病毒或细菌作为载体，将外源基因插入其基因组中的复制非必需区，构建重组疫苗。基因工程活载体疫苗安全性好，能够诱导产生广泛的免疫反应，生产成本低，其最大的优点是可以制备多联疫苗，达到一针防多病的效果。

1.1 表达BoHV-1 免疫原性蛋白的活载体疫苗研究 Bo-HV-1 免疫原性较强的蛋白如gB、gC、gD 等均有作为相关活载体疫苗靶标的报道。其中，gD 蛋白是BoHV-1 保护性抗原且免疫原性最好，也是研究最多的蛋白[4]。载体包括腺病毒、痘病毒、鸡新城疫病毒和沙门氏菌。表达BoHV-1 gC 或gD 蛋白的人复制缺陷型腺病毒5 型重组病毒能够诱导牛产生特异性抗体并对其提供免疫保护力[14]。表达gD 蛋白的重组新城疫病毒接种鸡后能够在其鼻腔分泌物中检测到gD 抗体，表明其产生了黏膜免疫[15]。表达gD 蛋白的牛3 型腺病毒在牛体也能够产生类似粘膜免疫反应，产生中和抗体，同时诱导特异性淋巴细胞增殖；攻毒后临床症状减轻，排毒量降低[16]。表达BoHV-1 gD 蛋白的安卡拉牛痘病毒(MVA-gD)，与霍乱毒素(佐剂)混合后以两倍剂量鼻腔接种小鼠，不但诱导小鼠产生了黏膜IgA，同时诱导产生了gD 抗体，然而单次接种产生的抗体水平很低[17]。

细菌载体主要有沙门氏菌和大肠杆菌等。将表达Bo-HV-1 gD 蛋白的重组鼠伤寒沙门氏菌LVR03 弱毒株经鼻腔接种BALB/c 小鼠后，机体产生了针对gD 蛋白和全病毒的体液免疫反应，唾液中检测到特异性IgG 和IgA，同时检测到了细胞免疫应答(淋巴细胞增殖及淋巴因子释放)[18]。

1.2 BoHV-1 作为活载体的疫苗研究 BoHV-1 本身也被用作活载体构建载体疫苗，其优点是：安全性好、宿主范围窄、不感染人，BoHV-1 基因组中有许多病毒复制非必需基因，允许插入多个外源基因，从而产生同时针对两种或以上病原体的免疫反应。

外源基因插入位点常选择BoHV-1 的非复制必需基因，包括gB、gC、gE、gG、tk 等。如将伪狂犬病病毒gB、gC、gD、gE 基因插入至BoHV-1 的tk 或 gC 基因中，小鼠免疫试验表明该重组病毒诱导小鼠产生了针对PRV攻毒的保护力[19]。将O 型口蹄疫病毒(FMDV)VP1 基因插入到BoHV-1 的gE 基因中构建的重组病毒BoHV-1 gE-/VP1，接种兔体后产生了针对BoHV-1 的中和抗体，且在加强免疫后其中和抗体滴度显著增加[20]。表达BVDV-1 和BVDV-2 E2 蛋白的BoHV-1 重组病毒，接种牛一周后即可产生BoHV-1 的ELISA 抗体，在免疫后6 周～8 周其中和抗体滴度在25～27 之间，且能够维持8 周[21]。然而，这些研究大部分侧重于对外源基因产生的免疫水平的检测，而缺乏对BoHV-1 免疫保护力的有效评价，目前尚未有产品应用于市场。

3 亚单位疫苗

亚单位疫苗是指利用病原微生物的一种或多种保护性抗原蛋白制成的不含核酸、能够诱导机体产生免疫应答的疫苗。主要优点包括：不含活病原体，安全性好，且便于规模化生产。

据报道，利用吸附纯化的BoHV-1 中的病毒膜蛋白和免疫刺激复合物(Immunostimulatory complex，ISCOM)制备的亚单位疫苗，免疫6 月龄IBR 血清阴性牛，共接种3次，其诱导产生的中和抗体滴度高于商品化弱毒苗，并大幅减少了攻毒后的排毒量[22]。利用BoHV-1 截短gpi 基因制备的亚单位疫苗能够诱导局部黏膜免疫反应，同时也能够诱导系统性体液免疫应答(特异性IgG 和血清中和抗体升高)和细胞免疫(刺激外周血淋巴细胞增殖能力加强)，并具有攻毒保护力[23]。此外，截短或全长gD 蛋白亚单位疫苗均能够在小鼠体内诱导体液免疫和细胞免疫而减少病毒的增殖和潜伏，并提供一定的保护效力[24]。新型Th1型免疫促进物CpG 寡聚脱氧核苷酸(Oligodeoxynucleotides containing unmethylated CpG dinucleotides， CpG ODN)与BoHV-1 gD 亚单位疫苗混合免疫后，能够诱导机体产生高水平的IgG2a、中和抗体及IFN-γ，如果与传统佐剂如矿物油佐剂联合使用，不仅可以减轻局部反应，而且可以同时诱导Th1 和Th2 型免疫反应，使得免疫反应更强、更平衡和更全面[25]。

亚单位疫苗也可以制成二联甚至多联疫苗，如据报道将BVDV E2 蛋白主要抗原表位和BoHV-1 gD 蛋白主要抗原表位串联表达后制成的亚单位疫苗，免疫家兔后，可以诱导其产生效价为44.7 的中和抗体[26]，有望将其进一步开发成BVDV 和BoHV-1 二联亚单位疫苗。

然而亚单位疫苗无法在动物体内复制，所以，免疫效力不持久，需要多次免疫，合适的佐剂才可以提高免疫反应，部分克服亚单位疫苗免疫力不足或免疫反应不平衡等缺点。目前IBR 的亚单位疫苗仍然处于实验室研究阶段。

4 DNA疫苗

DNA 疫苗是将病原的保护性基因重组到真核表达载体后再导入到动物体内表达出相应的抗原。DNA 疫苗能够在体内复制，通过长时间的抗原表达来延长免疫应答持续时间，能够同时诱导体液免疫和细胞免疫，安全性好，且适于大规模生产，便于运输和保存。

与活载体疫苗和亚单位疫苗类似的是，BoHV-1 DNA疫苗通常将gD 作为靶基因。如编码BoHV-1 gIV 蛋白(即gD 蛋白)的DNA 疫苗在小鼠和牛体内产生较强的中和抗体，同时降低排毒量[27]。编码BoHV-1 截短gD 的DNA疫苗能诱导牛体内特异性淋巴细胞的增殖，产生IFN-γ[28]。母羊免疫BoHV-1 截短gD 的DNA 疫苗后，在母源抗体存在的情况下，仍然能够诱导新生羔羊体内T 淋巴细胞反应，这在临床应用中意义重大[29]。此外，携带BoHV-1 gD 基因的质粒还能够诱导小鼠产生黏膜免疫反应[30]。

虽然DNA 疫苗克服了亚单位疫苗无法复制的缺点，但表达单一蛋白的DNA 疫苗单独使用时其抗体的产生量和形成的保护力通常不是很充足。如同时编码BoHV-1 gD 和gB 蛋白的重组质粒在小鼠体内能够比单一质粒诱导更高水平的体液免疫和细胞免疫反应，产生更高滴度的中和抗体[31]。因此，在同一质粒中同时插入多个保护性抗原基因或功能性基因，表达嵌合蛋白，以诱导更全面而平衡的免疫应答，是研制IBR 新型DNA 疫苗的方向。B 淋巴细胞表面的CD40 分子和其配体CDl54 相互作用是B 细胞活化的辅助刺激信号，在同一质粒中插入编码牛CD154 基因和截短 BoHV-1 gD 基因的 DNA 疫苗 tgDCD154，与仅含截短BoHV-1 gD DNA 疫苗相比，前者诱导B 淋巴细胞增殖的能力更强，且PBMCs 增殖能力提高两倍，血清IgG 和IgA 抗体也显著增加[32]。给药方式对含BoHV-1 gD 基因的DNA 疫苗的免疫效果也有影响，分别以肌肉注射、皮下注射和滴鼻的方式接种牛时，肌肉注射组牛在一免后21 d～42 d 可以检测到中和抗体，且产生了清除病毒的作用，而其余两种接种方式免疫后未检测到中和抗体，免疫反应弱，不能有效清除病毒[33]。有趣的是，表达BoHV-1 gD 的制成栓剂从阴道给药，能够在血清和鼻腔分泌物中均检测IgG 和IgA 抗体，攻毒后8 d 其中和抗体滴度大于64，且排毒量和排毒时间均减少[34]。另外，基因枪也应用于接种gD DNA 疫苗[35]。同时，佐剂能够大幅提高IBR DNA 疫苗在小鼠[36]和牛体[37]的免疫反应。

5 免疫保护评价标准

免疫效力评价指标是所有IBR 疫苗面临的困境，一般采用中和抗体单指标和临床症状多指标两种评价体系。

感染BoHV-1 后能够引起非特异性和特异性免疫应答，非特异性免疫由中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞，NK 样细胞等介导，特异性免疫包括由B 淋巴细胞介导的体液免疫和T 淋巴细胞介导的细胞免疫。体液免疫对动物体免受BoHV-1 的感染十分重要，体液免疫产生的中和抗体(OIE 规定的黄金准则)可以阻止病毒入侵和黏附，也可以中和细胞外和接种部位的病毒，还可以通过与补体结合裂解被感染细胞或产生抗体依赖性细胞毒性反应。机体发生细胞免疫时，Th1 和Th2 类细胞均能够产生并分泌白介素和干扰素等细胞因子，它们能够激活效应细胞从而抑制病毒增殖，这些效应细胞可以直接杀死或与产生的抗体协同作用杀死被感染细胞，检测指标主要包活淋巴细胞增殖、细胞毒性反应和产生的细胞因子。细胞免疫在初次感染后的恢复中起重要作用，但必须与非特异性免疫和体液免疫协同作用才能快速清除病毒[38]，也有研究表明，只有当诱导产生较强的体液免疫时，保护力与细胞免疫之间才具有相关性[39]，且再次感染时，体液免疫(主要为中和抗体)在阻止感染和清除病毒方面起着更为重要的作用[40]。事实上，大部分现有的疫苗尤其是灭活苗能够引起强烈的体液免疫但不能引起细胞免疫，此时，疫苗的免疫效力就与体液免疫和攻毒后的保护水平相关，因此，对疫苗的免疫评价中，就有以中和抗体为评价指标的，如van Drunen等在对BoHV-1 gIV(gD)亚单位疫苗的研究中发现，该亚单位疫苗能够诱导机体产生黏膜免疫和体液免疫应答，在鼻腔分泌物和血清中均检测到中和抗体，其水平与攻毒后形成的保护力之间具有很强的相关性[40]，国内学者郭利等也得到了类似的结论，他们的研究表明BoHV-1 LNM 株弱毒疫苗的保护效力与中和抗体水平之间存在一定的平行关系[41]。以中和抗体为指标评价非常简单、客观，但是也不能一概而论，有学者构建了表达BoHV-1 gC 蛋白的人复制缺陷型腺病毒5 型重组病毒，其诱导的中和抗体水平很低，但所有动物均获得了保护力，表明中和抗体并不能成为所有疫苗的评价指标[42]，也有学者报道中和抗体与保护力之间并无统计学相关性[43]。

世界动物卫生组织(OIE)多指标评价体系核心即攻毒后的临床症状，其规定在攻毒后免疫组牛不应表现症状或仅表现轻微症状，免疫组牛经鼻腔排毒的最高病毒滴度应比对照组牛至少低100 倍，该组牛的排毒期应比对照组至少减少3 d，Quattrocchi 等在评价佐剂对BoHV-1 DNA 疫苗的作用时就应用了该评价标准[37]。这种评价体系利用免疫-攻毒的模式来评价疫苗的效力，非常直接且明确，但在临床症状评价中，可能由于人为或环境因素的影响，使结果有所偏差。因此，在评价一种IBR 疫苗时，应当尽可能全面且客观，结合各种要素，对其进行全方位地评价。

6 小结和展望

目前尚无针对IBR 的特效药物，主要采取对症治疗原则，使用抗生素等药物，所以接种疫苗仍是防控该病的重要手段。各种疫苗均有优缺点，但基因缺失疫苗由于具有免疫标识为该病的防控与净化提供了更好的选择。利用新技术手段，鉴定和发现新型标记基因，进一步提高其安全性和免疫原性，是基因工程缺失疫苗的未来研发方向。同时，鉴于现有OIE 免疫评价指标体系过于复杂，中和抗体评价与免疫效力相关性存在争议，因此，研究与优化疫苗免疫保护性相关的免疫效力评价指标有利于提高各类疫苗在该病控制和净化中的推广应用。

虽然仍有一些发达国家如瑞士等禁止使用IBR 疫苗，采用检疫捕杀的策略来根除该病，但该法并不适用于我国这样的发展中国家。目前我国主要利用接种传统疫苗来预防IBR，而传统疫苗不利于该病的净化，新型的基因工程疫苗成为研究热点，且大有发展和改善空间，国内很多学者也做了相关的研究，然而基因工程疫苗需要经过严格的评审，主要考虑到转基因生物安全问题，需要进行一系列的田间实验，耗时较长，产品上市较缓慢，不过，相信随着各类基因工程疫苗的不断发展完善，在不久的将来，发展中国家最终也能彻底根除IBR，为促进我国养牛业的健康发展作出贡献。