银杏叶黄酮的富集及抗氧化活性的研究*

2019-01-10邱福祥谢懿涵阮威威林国荣

食品工程 2018年4期

邱福祥谢懿涵阮威威林国荣*

（莆田学院环境与生物工程学院，福建省新型污染物生态毒理效应与控制重点实验室，福建莆田 351100）

银杏是我国独有树种，资源总量占全世界的90%，银杏叶产量占世界的70%。银杏树被赋予“神奇的医疗之树”美称，其作为药用己有六百多年的历史。近些年来，国内外学者与科研机构对银杏叶的活性成分及其分离纯化技术、药理实验和临床应用进行了大量的研究工作。银杏叶中含有的黄酮类化合物种类超过40种，具有极强的清除自由基和抗氧化能力，故而广泛用于预防和治疗心脑血管疾病。银杏叶提取物在治疗和预防疾病方面具有显著的功效，其应用之广涉及医药、生物农药、兽药、食品、化妆品等。

黄酮类化合物广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成份。众多研究显示，黄酮类化合物具有广泛的生物活性，包括抗氧化、抗突变、抗衰老、抗肿瘤、抗菌、调节血管渗透等作用，其中最为重要的是黄酮类化合物的抗氧化活性，主要表现在减少自由基的产生和清除自由基两方面。本试验通过乙醇浸提法提取银杏叶黄酮，着重考察大孔树脂分离银杏叶黄酮的工艺。通过静态实验筛选出适宜富集介质，并动态考察其适宜上样流速、上样浓度、洗脱流速、洗脱剂浓度和洗脱量；通过化学方法检测银杏叶黄酮对超氧阴离子、羟自由基的清除作用及小鼠常压耐缺氧试验，初步了解银杏叶黄酮的抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 供试材料

干燥银杏叶，购于莆田紫金药店；动物，清洁级昆明种小鼠，雌雄各半，体重（20±1.8）g，由福建医大实验动物研究所提供。

1.2 主要试剂与仪器

乙醇、AlCl3、Tris、盐酸、硫酸亚铁等均为分析纯；卢丁标准品，中国药品生物制品检定所。

HZ816大孔吸附树脂，华东理工大学华震科技有限公司；D101、HZ816、HPD450、AB-8大孔吸附树脂，天津光复精细化工研究所；聚丙烯酰胺树脂。

BHZ9146A电热恒温干燥器；BS224S电子天平，Sartorius公司；Spectrun752型紫外-可见分光光度计；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵；EYELA N-1000旋转蒸发仪，EYELA公司；DBS-100自动分部收集器，上海沪西分析仪器厂；THZ-82恒温振荡器，江苏天由有限公司。

1.3 方法

1.3.1 总黄酮含量测定方法

黄酮吸光度测定：取1 mL样品液于试管中，依序加入0.5 mL质量分数1%AlCl3溶液和2 mL水，混合均匀后静置10 min，然后于420 nm比色测定，参比对照时，AlCl3改为水，当测定结果不在分光光度计适合范围内的，则对样品液进行适当浓缩或稀释至测定吸光度在0.4～0.9之间。

芦丁标准溶液的配制：准确称取芦丁标准品0.010 0 g，用体积浓度50%的乙醇溶解，并用50 mL容量瓶定容，摇匀，得到芦丁标准溶液的浓度为0.20 mg/mL。

芦丁标准工作溶液的配制：分别吸取芦丁标准溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL、8.0 mL于10 mL的容量瓶中定容，摇匀配成不同质量浓度芦丁标准工作溶液进行测定。以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=0.933x-0.004 8，R2=0.999 1。

1.3.2 银杏叶总黄酮的提取

将银杏叶置于烘箱干燥，精确称取一定量，置于烧杯中，并按固液比1 g∶18 mL加入体积浓度65%乙醇，放入HH-4型数显恒温水浴锅中70℃浸提3 h，进行银杏叶总黄酮提取，提取液经过滤、旋转蒸发仪浓缩到一定体积，备用。

1.4 银杏叶黄酮的分离纯化

1.4.1 大孔树脂预处理

将各种型号吸附树脂经过一定处理后再用乙醇浸泡24 h，并用蒸馏水洗至无醇味，备用。

1.4.2 富集介质筛选

静态吸附容量的测定：量取已处理好的D101、HZ816、HPD450、AB-8大孔吸附树脂、聚丙烯酰胺树脂各5.0 mL，分别置于100 mL具塞三角烧瓶中，各加入20.0 mL银杏叶黄酮溶液，盖紧瓶塞，置于恒温振荡器中恒温振荡，另取一个具塞三角烧瓶加入20.0 mL银杏叶黄酮溶液作为对照组一并放入恒温振荡器，振荡9 h充分吸附后,取吸附余液测定银杏叶黄酮含量，按式（1）计算吸附量，按式

（2）计算吸附率。

将上述各瓶中混合液进行过滤，去除吸附余液，再将其置于锥形瓶中，加入体积浓度65%乙醇30.0 mL，封口置振荡器中振荡2 h，检测各树脂解析液银杏叶黄酮含量，按式（3）计算解吸率。

式中：C0——样液质量浓度，mg/mL；

C——吸附后样液中总黄酮质量浓度，mg/mL；

V——样液体积，mL；

Vs——树脂体积，mL；

C1——解吸液中总黄酮质量浓度，mg/mL；

V1——洗脱剂体积，mL。

1.4.3 树脂HPD450对银杏叶黄酮的富集

1.4.3.1 动态吸附

量取15mL处理好的HPD450大孔吸附树脂，湿法装柱。基本条件为分别上样黄酮样品液150mL，通过改变上样液流速（1 BV/h、2 BV/h、3 BV/h）和上样液质量浓度（0.367 5 mg/mL、0.551 3 mg/mL、0.735 0 mg/mL）的试验，用分部收集器收集流出液，测定其吸光度，确定最适上样流速和上样液质量浓度。

1.4.3.2 动态洗脱

按相同上样条件进行吸附，上样量为50 mL黄酮浓缩液用水稀释成100 mL，吸附后用一定流速和90 mL一定体积乙醇进行洗脱，分部收集测定其吸光度，通过改变洗脱流速（2 BV/h、3 BV/h）和乙醇体积浓度（50%、65%、80%）的试验，考察其适宜洗脱流速和洗脱液浓度。

1.4.3.3 工艺验证

按照以上确定的适宜工艺条件重复试验5次，得到全部洗脱液浓缩后冻干，再称取一定量冻干品溶于适量乙醇,测定总黄酮吸光度，计算其得率和纯度。

1.4.4 银杏叶黄酮的抗氧化活性

1.4.4.1 银杏叶黄酮对超氧阴离子的清除作用

取5份5 mL pH8.2 Tris-HCl缓冲液，分别加入提取液质量浓度1/5、2/5、3/5、4/5和提取液5种不同质量浓度银杏叶黄酮溶液20 μL，再加5 μL 50 mmol·L-1邻苯三酚，摇匀。以pH8.2 Tris-HCl缓冲液为空白对照，测定不同时间的吸光度，按式（4）计算抑制率。

式中：A0——空白吸光度；

A1——加黄酮样液的吸光度。

1.4.4.2 银杏叶黄酮清除羟自由基的作用

采用邻二氮菲-Fe2+氧化法检测H2O2/Fe2+产生的羟自由基的方法考察银杏叶黄酮对羟自由基的清除作用。取4支试管，分别加入0.75 mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液1 mL、0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.40）2 mL、蒸馏水1 mL（第3支用0.735 mg/mL银杏叶黄酮、第4支用0.5 mg/mLVc代替蒸馏水）、然后各加入0.75 mmol/L新配制硫酸亚铁溶液1mL和质量分数0.01%新配制双氧水1mL（其中第2支用溶液用1 mL蒸馏水代替双氧水）。37℃水浴加热60 min，在536 nm波长测定的吸光度，测得各支试管的数据分别为：①损伤管的吸光值A损、②未损伤管吸光值A未、③银杏叶黄酮样品管吸光度A样、④Vc阳性对照管吸光度A阳。按式（5）计算清除率。

1.4.4.3 小鼠常压耐缺氧试验

昆明种小鼠随机分为4组（n=6），分别为总黄酮高、中、低剂量组（分别为100 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg）和空白对照组（等体积的生理盐水）。连续灌胃给药7 d后，把小鼠放入盛有5g钠石灰的250 mL广口瓶中，加盖密封，以呼吸停止（小鼠胸部不起伏）为指标，记录小鼠死亡时间。

2 结果与分析

2.1 银杏叶提取液黄酮含量

按照1.3.2方法提取银杏叶黄酮，提取液经过滤、浓缩，测定提取液在波长420 nm下的吸光度，按回归方程计算得提取液黄酮质量浓度为0.735 mg/mL。

2.2 银杏叶黄酮适宜富集介质的确定

据1.4.2方法筛选富集介质，结果如表1。

由表1可看出各种吸附树脂吸附性能大小比较为：D101＞HPD450＞HZ816＞AB-8＞聚酰胺树脂；用体积浓度65%乙醇作为洗脱剂的解吸效果比较为：聚酰胺树脂＞HPD450＞D101＞AB-8＞HZ816。由此可知，聚酰胺树脂洗脱率最高，但是吸附效果并不理想；而HPD450的吸附效果只比D101略小，洗脱率也只比聚酰胺树脂略小。综合考虑，选择HPD450大孔吸附树脂作为银杏叶黄酮的富集纯化的适宜介质。

2.3 HPD450树脂对银杏叶黄酮的纯化条件选择

2.3.1 吸附流速的确定

试验结果见图1。

图1 上样流速对银杏叶黄酮吸附的影响

由图1可知，不同流速下漏出液黄酮的浓度值随着上样量的增大而增高，漏出点均在第4管附近；3 BV/h流速吸附效果较差，1 BV/h和2 BV/h条件下吸附率相近，而2 BV/h速率效果略好，节省时间。故适宜流速为2 BV/h。

2.3.2 上样浓度的确定

试验结果见图2。

图2 上样液浓度对银杏叶黄酮吸附的影响

由图2可看出用0.3675 mg/mL、0.5513 mg/mL、0.735 0 mg/mL3种不同质量浓度黄酮溶液进行上样，上样浓度越小则吸附率越高。故适宜上样液浓度为0.3675mg/mL。

2.3.3 适宜洗脱流速的确定

试验结果见图3。

图3 流速对银杏叶黄酮洗脱的影响

由图3可知在3 BV/h和2 BV/h两种不同洗脱流速的洗脱效果相当，3 BV/h洗脱速率下波峰出现较早且高。考虑到时间问题，确定适宜洗脱流速为3 BV/h。

2.3.4 洗脱剂浓度的确定

试验结果见图4。

图4 乙醇体积浓度对银杏叶黄酮洗脱的影响

由图4可知，3种不同浓度乙醇作为洗脱剂时，都在使用50 mL乙醇洗脱后洗脱液黄酮含量显著变小；体积浓度80%乙醇洗脱曲线峰形较好、无拖尾、洗脱集中；而体积浓度50%乙醇的效果较差，拖尾严重。故适宜洗脱剂为体积浓度80%乙醇溶液。

2.3.5 工艺验证结果

上样液中银杏叶总黄酮总量为1.766 g，银杏叶总黄酮洗脱量分别为1.50 g、1.54 g、1.52 g、1.56 g、1.47 g，平均收集量为1.52 g，平均得率为86.1%；测定并计算得银杏叶总黄酮纯度为34.2%。说明该工艺是可行的。

表2 不同浓度银杏叶黄酮对超氧阴离子的抑制率

2.4 银杏叶总黄酮抗氧化活性

2.4.1 对超氧阴离子的清除作用

每隔0.5 min测定一次吸光度，考察银杏叶提取液对对邻苯三酚自氧化产生的超氧阴离子自由基的清除作用，结果见表2。由表2可知，空白3 min时的自氧化率为0.076 7 A/min；随着银杏叶黄酮浓度的升高，其对超氧阴离子的抑制率也增高；提取液3 min时的氧化抑制率为45.63%。结果表明，银杏叶黄酮对超氧阴离子的清除作用效果显著。

2.4.2 对羟自由基的清除作用

通过邻二氮菲-Fe2+氧化法检测H2O2/Fe2+产生的羟自由基，考察银杏叶提取液对羟自由基的清除作用，结果如表3。