黄花石莲总黄酮超声辅助提取及抗氧化活性研究*

李瑶佳 王 君 毛 攀 伍仕杰 江文世*

（西昌学院农业科学学院，四川西昌 615000）

黄花石莲 （Sinocrassulaindica var.Luteorubra）属于石莲的一个变种，是景天科（crassulaceae）多年生无毛草本植物。在我国，黄花石莲主要生长在云南贡山地区海拔3 300 m～3 700 m的岩石隙中以及四川西南山区。黄花石莲中含有黄酮（flavonoids）、黄菲素（flavidin）、D-葡萄糖（D-glucose）、鼠李糖（rhamnose）、L-阿拉伯糖（L-arabinose）等种类繁多的化合物。其叶片可煮汤食用，也可入药使用，具有滋阴益气、散瘀消肿、控制血糖等功效。黄酮类化合物是一类具有苯环和羟基结构化合物的总称，具有止咳、抑菌、消炎、抗氧化、预防心脑血管疾病等方面的作用。黄酮类物质易溶于丙酮、水、乙酸乙酯、乙醇等极性较大的溶剂中。植物中的总黄酮通常采用乙醇或丙酮提取。本文以黄花石莲的叶为原料，采用超声辅助提取黄花石莲中总黄酮，研究乙醇、丙酮和丙酮-乙醇作为提取溶剂对黄花石莲总黄酮的提取率，并通过正交试验对提取工艺条件进行优化。同时，以抗坏血酸作为阳性对照，测定不同质量浓度的黄花石莲总黄酮提取液对1，1-苯基-2-苦肼基（DPPH·）自由基、羟基自由基（·OH）和超氧阴离子自由基（O2-·）的清除能力，评价其抗氧化活性，旨在为更好地开发利用黄花石莲中黄酮类化合物提供数据支撑。

1 材料及方法

1.1 原料与试剂

黄花石莲采自四川省西昌市礼州镇；焦性没食子酸、水杨酸、七水合硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）、过氧化氢、盐酸、冰乙酸、甲醇、无水乙醇、丙酮，均为分析纯，成都市科龙化工试剂厂；无水三氯化铝，分析纯，天津市大茂化学试剂厂；芦丁标准品，合肥博美科技生物有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris），分析纯，上海瑞永生物科技有限公司；乙酸钾、抗坏血酸，分析纯，天津市光复化工研究所；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH），梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；实验用水均为超纯水。

1.2 试验仪器与设备

UV 5800PC型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；KH-250SPV双频数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；HR-04多功能粉碎机，上海哈瑞斯电器有限公司；SHB-III循环水式多用真空泵，巩义市英峪华科仪器厂；DHG-9140B智能型电热鼓风干燥箱，上海成顺仪器仪表有限公司；RE-201D旋转蒸发仪，河南兰帆科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黄花石莲样品制备

黄花石莲叶→挑选→自来水洗→超纯水洗→烘箱干燥→粉碎→过筛→样品。

1.3.2 标准曲线绘制

总黄酮含量测定参照标准NY/T1295-2007的方法。分别吸取0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL芦丁标准溶液于10 mL比色管中，加入1 mL 0.1 mol/L的AlCl3溶液和1 mL 1 mol/L的乙酸钾溶液，用体积浓度70%的甲醇定容至刻度，得到芦丁质量浓度分别为 0 mg/mL、0.021 mg/mL、0.042 mg/mL、0.063 mg/mL、0.084 mg/mL的溶液，静置30 min，用分光光度计在419 nm处测定溶液的吸光度，以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线见图1。线性回归方程为：y=29.61x+0.052；R2=0.999。

图1 芦丁标准曲线

1.3.3 不同溶剂对黄花石莲总黄酮的提取

准确称取1.000 g黄花石莲样品于锥形瓶中，用不同的溶剂（乙醇、丙酮、丙酮-乙醇）提取，提取溶液体积浓度为75%、超声温度为50℃、超声时间30 min、料液比为1 g∶30 mL，重复3次，随带试剂空白。

1.3.4 丙酮-乙醇对黄花石莲中总黄酮的提取

准确称取1.000 g黄花石莲样品于锥形瓶中，加入一定体积比、体积浓度的丙酮-乙醇混合提取液，在一定时间和温度条件下进行超声提取，减压抽滤，收集滤液后旋转蒸发浓缩，用丙酮-乙醇混合溶液定容至50 mL，重复3次，随带试剂空白。总黄酮提取率按下列公式计算：

式中：C——待测溶液的吸光度值带入回归方程计算得到的总黄酮的质量浓度，mg/mL；

V——待测溶液的体积，mL；

D——溶液的稀释倍数；

m——样品的质量，g。

1.3.5 单因素试验设计

分别考察超声时间、超声温度、料液比、丙酮-乙醇体积比、混合提取溶液体积浓度对黄花石莲总黄酮提取率的影响。①超声时间采用20 min、30 min、40 min、50 min、60 min的条件进行单因素试验，超声温度为50℃、料液比为1 g∶30 mL、丙酮-乙醇体积比为1∶3、混合提取溶液浓度为75%；②超声温度采用30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的条件进行单因素试验，超声时间为30 min、料液比为1 g∶30 mL、丙酮-乙醇体积比为1∶3、混合提取溶液体积浓度为75%；③料液比采用1 g∶30 mL、1 g∶35 mL、1 g∶40 mL、1 g∶45 mL、1 g∶50 mL的条件进行单因素试验，超声时间为30 min、超声温度为50℃、丙酮-乙醇体积比为1∶3、混合提取溶液体积浓度为75%；④丙酮-乙醇体积比采用 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的条件进行单因素试验，超声时间为30 min、超声温度为50℃、料液比为1 g∶30 mL、混合提取溶液体积浓度为75%；⑤混合提取溶液体积浓度采用75%、80%、85%、90%、95%的条件进行单因素试验，超声时间为30 min、超声温度为50℃、料液比为1 g∶30 mL、丙酮-乙醇体积比为1∶3。

1.3.6 正交试验

根据单因素试验结果，选取超声温度、料液比、丙酮-乙醇配比、混合溶液浓度，做L9（34）正交试验，优化提取条件，正交试验设计表见表1，并采用方差分析来研究4个因素对黄花石莲总黄酮提取率影响的显著性水平。

表1 正交优化试验因素水平表

1.3.7 黄花石莲总黄酮抗氧化活性测定

将超声辅助提取得到的总黄酮提取液分别配置 为 0.059 mg/mL、 0.118 mg/mL、 0.177 mg/mL、0.236 mg/mL、0.295 mg/mL和0.354 mg/mL 6个不同质量浓度，研究其抗氧化能力。

参照文献的方法测定黄花石莲总黄酮溶液清除DPPH·的能力。取6支10 mL比色管加入1 mL不同质量浓度的黄花石莲总黄酮提取液，再分别加入2.5 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，混合反应30 min，在波长517 nm处用分光光度计测定吸光度值，记为Di；超纯水代替样品溶液测定的吸光度值，记为Dc；无水乙醇代替DPPH·乙醇溶液测定的吸光度值，记为Db，以抗坏血酸作为阳性对照。黄花石莲中总黄酮对DPPH·清除率计算公式为：

1.3.7.2 黄花石莲中总黄酮清除·OH的测定

参照文献的方法测定黄花石莲总黄酮溶液清除·OH的能力。取6支10 mL比色管，加入1 mL不同质量浓度的黄花石莲总黄酮提取液，再分别加入9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、9 mmol/L FeSO4溶液、8.8 mmol/L的H2O2溶液各2 mL，用超纯水定容至刻度，37℃水浴反应30 min，在波长510 nm处用分光光度计测定吸光度值，记为DX，超纯水代替H2O2溶液测定的吸光度值，记为DX0，超纯水代替样品溶液测定的吸光度值，记为D0，同时，以抗坏血酸作为阳性对照。黄花石莲总黄酮对·OH清除率计算公式为：

1.3.7.3 黄花石莲总黄酮清除O2-·的测定

参照文献的方法测定黄花石莲总黄酮溶液清除O2-·的能力。取6支10 mL比色管分别加入1 mL不同质量浓度的黄花石莲总黄酮提取液、4.5 mL Tris-HCl溶液（50 mmol/L，pH=8.2）混匀，于 25 ℃恒温水浴反应20 min，取出后加入25℃预热好的邻苯三酚溶液（3 mmol/L）0.3 mL，以 0.3 mL盐酸（10 mmol/L）代替作参比，混匀后迅速在波长为325 nm处测定吸光度，每隔30 s测定一次，总共测定5 min。计算黄花石莲总黄酮溶液的吸光度随时间的变化率，记为Fx；用超纯水代替样品溶液，按同样方法测定吸光度，计算空白液的吸光度随时间的变化率，记为F0。黄花石莲总黄酮对O2-·清除率计算公式为：

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 不同提取溶剂对提取率的影响

试验结果见表2。由表2可知，不同提取溶剂对总黄酮的提取率从大到小依次为丙酮-乙醇＞乙醇＞丙酮，提取率分别为1.207%、1.195%和1.250%。因此，选择丙酮-乙醇混合溶液作为提取溶剂，来进行下一步总黄酮提取率的研究。

表2 不同提取溶剂对总黄酮提取率的比较（x±s，n=3）

2.1.2 超声时间对提取率的影响

农业生产中防灾减灾工作对气象的依赖程度越高，对农业气象工作者服务准确度的要求就会越高。因此，应结合我国实际来完善我国的气象预报系统，而且基层气象部门要对农业气象工作起到推进作用。

试验结果见图2。

图2 超声时间对总黄酮提取率的影响

由图2可知，超声时间在20 min～60 min范围内，黄花石莲中总黄酮提取率呈先上升后下降的趋势，在50 min时，得到最高提取率为1.255%。结果表明，超声时间对黄花石莲总黄酮提取率有一定影响。超声时间太短，提取液不能充分渗透进植物细胞中将黄酮类化合物提取出来，提取率较低；超声时间太长，黄酮类化合物稳定性降低以及一些非黄酮类物质溶出增加，与黄酮类化合物的溶解形成竞争性抑制，导致提取率降低。因此，选择最佳超声时间为50 min。

2.1.3 超声温度对提取率的影响

试验结果见图3。

图3 超声温度对总黄酮提取率的影响

由图3可知，超声温度在30℃～70℃范围内，总黄酮提取率随温度的升高而增加，在50℃时，得到最高提取率为1.232%，继续升高温度，总黄酮提取率逐渐下降。这是因为随着温度升高，分子间的运动速度加快，黄酮类化合物在提取液中的溶解度逐渐增加，提取率增加。继续升高温度，总黄酮提取率降低，这是由于温度太高，黄酮类化合物结构被破坏，乙醇和丙酮挥发，提取液浓度降低，导致总黄酮提取率下降。因此，选择40℃、50℃、60℃三个水平进行下一步正交试验。

2.1.4 料液比对提取率的影响

试验结果见图4。

图4 料液比对总黄酮提取率的影响

由图4可知，料液比在1g∶30mL～1 g∶50 mL范围内，总黄酮提取率随着料液比增大而增加，当料液比达到1 g∶40 mL时，继续增加料液比，总黄酮提取率趋于稳定，料液比为1 g∶50 mL时总黄酮提取率最大（1.258%）。料液比较低时，总黄酮不能充分溶解，增加料液比时可以提高总黄酮的溶出率；当料液比过大时，提取液中的总黄酮浓度降低，导致植物细胞内外浓度差下降，渗透压降低，影响总黄酮的溶出。而且料液比太大，后续溶剂蒸发和浓缩负荷太大，在保证提取效率的同时，应尽量减少溶剂用量。因此，选择1 g∶40 mL、1 g∶45 mL、1 g∶50 mL三个水平进行下一步正交试验。

2.1.5 丙酮-乙醇体积比对提取率的影响

试验结果见下页图5。

图5 丙酮-乙醇配比对总黄酮提取率的影响

由图5可知，丙酮-乙醇体积比在1:1～1:5范围内，总黄酮提取率随着混合提取液中乙醇比例的增加而增加，在体积比1∶4时，总黄酮提取率达到最高（1.324%），随后随着混合提取液中乙醇比例的增加而降低。这是由于当混合提取液中乙醇比例的增加，总黄酮中溶于乙醇和丙酮的化合物被提取出来，提取率升高，但是当乙醇比例增加到一定程度时，提取液中醇溶性物质达到饱和，且由于混合提取液中丙酮的比例降低，黄酮类化合物中能溶于丙酮的一些化合物也不能全部溶解，导致提取率降低。因此，选择1∶3、1∶4、1∶5三个水平进行下一步正交试验。

2.1.6 丙酮-乙醇混合溶液体积浓度对提取率的影响

试验结果见图6。

图6 混合溶液浓度对总黄酮提取率的影响

由图6可知，丙酮-乙醇混合溶液体积浓度在75%～95%范围内，总黄酮提取率随着混合溶液浓度的增加而增加，当混合溶液体积浓度为85%时，总黄酮提取率最大（1.384%），随着混合溶液体积浓度的继续增加，总黄酮提取率降低。这是由于混合溶液体积浓度增大，溶于丙酮-乙醇中的黄酮类化合物增加，提取率增加，当混合溶液浓度增加到一定程度时，黄酮中溶于水的部分，溶出量降低，并且随着混合溶液体积浓度继续增加，一些脂溶性物质会被提取出来，与黄酮类化合物的溶解形成竞争，导致总黄酮提取率下降。因此，选择混合溶液体积浓度为80%、85%、90%三个水平进行下一步正交试验。

2.2 正交试验结果

由正交试验结果表3和方差分析结果表4可知，4种因素对黄花石莲总黄酮提取率的影响由大到小为：混合提取液体积浓度＞超声温度＞丙酮-乙醇体积比＞料液比。其中超声温度、混合提取液体积浓度和丙酮-乙醇体积比对总黄酮提取率的影响达到了极显著水平（P＜0.01），料液比对总黄酮提取率的影响不显著（P＞0.05）。通过极差分析和方差分析可以得出黄花石莲中总黄酮提取的优化工艺组合为A2B2C2D2，即：超声时间50 min、超声温度50℃、丙酮-乙醇体积比为1∶4、丙酮-乙醇混合溶液体积浓度为85%、料液比1 g∶45 mL。在此工艺条件下进行验证试验，重复6次，黄花石莲总黄酮的平均提取率为1.677%，RSD为1.17%，大于正交试验表3中的最高提取率1.509%，为最终优化的黄花石莲总黄酮提取条件。

表4 正交试验方差分析表

2.4 黄花石莲总黄酮的抗氧化活性

2.4.1 黄花石莲总黄酮对DPPH·的清除能力

试验结果见图7。

图7 黄花石莲总黄酮对DPPH·的清除率

由图7可知，质量浓度在0.059mg/mL～0.354mg/mL范围内，黄花石莲总黄酮和抗坏血酸对DPPH·的清除能力随着质量浓度增大而增大。当总黄酮质量浓度为0.354 mg/mL时，DPPH·的清除率达到最大，为94.92%。与相同质量浓度的抗坏血酸相比，当质量浓度低于0.118 mg/mL时，对DPPH·的清除率低于抗坏血酸；当质量浓度高于0.118 mg/mL时，对DPPH·的清除率高于抗坏血酸。黄花石莲总黄酮对DPPH·最大清除率比抗坏血酸对DPPH·的最大清除率高3.18%。结果表明黄花石莲总黄酮具有较强的清除DPPH·的能力。

表3 正交试验结果（x±s，n=3）

2.4.2 黄花石莲总黄酮对·OH的清除能力

试验结果见图8。

图8 黄花石莲总黄酮对·OH的清除率

由图8可知，质量浓度在0.059mg/mL～0.354mg/mL范围内，黄花石莲总黄酮和抗坏血酸对·OH的清除能力随着质量浓度增大而增大。当总黄酮质量浓度为0.354 mg/mL时，对·OH的清除率达到最大，为23.96%。与相同质量浓度的抗坏血酸相比，黄花石莲总黄酮对·OH的清除率均低于抗坏血酸，但也表现出一定的清除·OH能力。

2.4.3 黄花石莲总黄酮对O2-·的清除能力

试验结果见图9。

图9 黄花石莲总黄酮对O2-·的清除率

由图9可知，质量浓度在0.059mg/mL～0.354mg/mL范围内，黄花石莲总黄酮和抗坏血酸对O2-·的清除能力随着质量浓度增大而增大。当总黄酮质量浓度为 0.354 mg/mL时，对O2-·的清除率最大，为18.91%。与相同质量浓度的抗坏血酸相比，黄花石莲总黄酮对O2-·的最清除率均低于抗坏血酸，但也表现出一定的清除O2-·能力。

3 结论

丙酮-乙醇混合溶液作为提取剂对黄花石莲总黄酮的提取率高于乙醇，而丙酮最低。通过单因素试验和正交试验，得出影响黄花石莲总黄酮提取率因素的大小为，混合提取液体积浓度＞超声温度＞丙酮-乙醇体积比＞料液比。其中超声温度、混合提取液体积浓度和丙酮-乙醇体积比对总黄酮提取率的影响达到了极显著水平（P＜0.01），料液比对总黄酮提取率的影响不显著（P＞0.05）。提取工艺条件为：超声时间50 min、超声温度50℃、丙酮-乙醇体积比为1∶4、丙酮-乙醇混合溶液体积浓度为85%，料液比1 g∶45mL。在优化工艺条件下进行验证试验，重复6次，得到黄花石莲总黄酮的平均提取率为1.677%，RSD为1.17%。质量浓度在0.059 mg/mL～0.354 mg/mL范围内，黄花石莲总黄酮和抗坏血酸对DPPH·、·OH、和O2-·的清除能力，随着质量浓度的增加而增加，当黄花石莲总黄酮质量浓度为0.354 mg/mL时，对DPPH·、·OH、和 O2-·的清除率最大，分别为94.92%、23.96%、18.91%。与相同质量浓度的抗坏血酸相比，其清除·OH和O2-·的能力均低于抗坏血酸，但是当质量浓度＞0.118 mg/mL时，其清除DPPH·的能力大于抗坏血酸。