抑制山药中多酚氧化酶活性的研究

段 勇

（江西省食品发酵研究所，江西宜春 336000）

山药，别名薯芋、薯药为薯科多年生草本植物薯芋的块根，冬季采挖，原产于亚热带，在我国已有几百年的栽培历史。山药营养丰富，供应时间长，适口性强，是深受人们喜食的蔬菜。山药除具有较广泛的食用价值外，还有较丰富的药用价值。其最大的特点是能够供给人体大量的黏液蛋白质，对人体有特殊的保健作用，能预防心血管系统的脂肪沉积，保持血管脉粥样硬化过早发生，减少皮下脂肪沉积，避免出现肥胖。作为高营养食品，山药中含有大量淀粉、蛋白质、B族维生素、维生素C、维生素E、葡萄糖、粗蛋白氨基酸、胆汁碱（choline）、尿囊素（allantoin）等。其中重要的营养成分薯蓣皂是合成女性荷尔蒙的先驱物质，有滋阴补阳、增强新陈代谢的功效；而新鲜块茎中含有的多糖蛋白成分的黏液质、消化酵素等，可预防心血管脂肪沉积，有助于胃肠的消化吸收。

但是山药在贮藏及加工过程中，尤其是山药去皮、切块后很容易产生褐变，主要原因是山药组织中的多酚氧化酶（PPO）及多酚类物质含量比较高，在有氧气存在的情况下，由多酚氧化酶（PPO）催化，内源的酚类物质生成邻醌，邻醌再相互聚合成醌或与蛋白质、氨基酸等作用生成高分子络合物而导致褐色素的生成，色素分子量愈高，颜色愈暗，从而导致褐变。

褐变不仅影响山药的外观，更重要的是降低了山药的营养价值。本试验通过对引起酶促反应的多酚氧化酶（PPO）活性的研究，探讨了pH值、温度、护色液（主要是添加抑制多酚氧化酶活性的抗氧化剂）等对山药褐变的影响，并据此提出抑制山药中多酚氧化酶活性的条件和方法，旨在为生产过程中防止山药褐变提供一定的理论依据。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验原料

山药，购于农贸市场，新鲜、未破损。

1.1.2 主要试剂

柠檬酸，上海试剂一厂；磷酸氢二钠，广州市重华化工有限公司；抗坏血酸，成都科龙化工试剂厂；EDTA，广东汕头市西陇化工厂；邻苯二酚，国药集团化学试剂有限公司。所用试剂均为分析纯。

1.2 主要试验仪器

723型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；GL-20B型冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；HH-8数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；TG328A分析天平，上海精密科学仪器有限公司；电热恒温干燥箱，上海跃进医疗器械厂。

1.3 试验方法

1.3.1 山药中PPO活性的测定

1.3.1.1 粗酶液的提取

称取10 g已去皮的新鲜山药，迅速用不锈钢刀片切片，然后转入研钵中，加入0.05 mol/L、pH值为5.6的磷酸缓冲溶液10 mL，研磨成匀浆。将匀浆转入离心管，在2℃～6℃、10 000 r/min离心15 min，上清液过滤后转入50 mL容量瓶中，用0.05 mol/L、pH值为5.6的磷酸缓冲溶液定容至刻度。再从50 mL容量瓶中移取5 mL酶液转入25 mL容量瓶中，用0.05 moL/L、pH值为5.6的磷酸缓冲溶液定容至刻度，4℃保存，等待PPO测定。

1.3.1.2 PPO活性的测定

空白对照：3 mL 0.05 moL/L、pH值为5.6的磷酸缓冲溶液+2 mL0.2 moL/L的邻苯二酚溶液，再加入1.0 mL在沸水中加热6 min的粗酶液，混匀。

反应体系：3 mL 0.05 moL/L、pH值为5.6的磷酸缓冲溶液+2 mL0.2 moL/L的邻苯二酚溶液，再加入1.0 mL粗酶液，混匀。溶液混匀后开始计时，在420 nm处测其吸光度（OD），每30 s记录1次，共记录5 min。以初始直线段的斜率（OD/t）计算酶活力。在测定条件下，每分钟引起吸光度改变0.001所需的酶量定义为1个相对酶活力单位。

1.3.2 pH值对PPO活性的影响

配制 pH 值为 2.4、2.8、3.2、3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6、6.0、6.4、6.8、7.2的系列磷酸缓冲液，按上述方法测定不同pH值的缓冲液与酶液及底物混匀后的吸光度，计算出PPO的相对活性。

1.3.3 温度对PPO活性的影响

以2.0 mL 0.2 moL/L的邻苯二酚为底物，加入pH值5.6的磷酸缓冲溶液3.0 mL，分别在0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃保温6 min，对应加入相同温度下保温6 min的PPO粗酶液1.0 mL，混匀迅速后测定吸光度，计算出PPO的相对活性。

1.3.4 护色液配比对PPO活性的影响

参照《GB2760食品添加剂使用标准》中蔬菜抗氧化剂最大使用量，配制不同质量分数EDTA、抗坏血酸与柠檬酸混合护色液，将山药去皮，切成不同厚度薄片浸在护色液中护色3.5 h，沥干后依据前述方法制成粗酶液，在pH值5.6的缓冲液中测定其PPO活性。以未经过护色的山药制得的酶液为对照，比较不同配比护色液对山药多酚氧化酶的抑制作用。试验以不同山药切片厚度、EDTA质量分数、抗坏血酸质量分数与柠檬酸质量分数为研究因素，以PPO相对活性为考察指标，设计四因素三水平正交试验对护色条件进行优化，因素水平见表1。

表1 山药护色正交试验因素水平

2 结果与分析

2.1 pH值对PPO活性的影响

试验结果见下页图1。

图1 pH与PPO相对活性的关系

由图1可知，pH在2.4～5.6之间，山药中多酚氧化酶（PPO）的活性随pH值的升高而增强，到达pH5.6时活力最强；在pH5.6～7.2之间，随pH值的升高明显减弱，升高到pH7.2时，多酚氧化酶（PPO）的活性趋近为零；酶活性最高时的pH值为5.6。pH值对PPO活性的影响显著，通过调节pH值能有效抑制PPO的活力。因此，在抑制山药中多酚氧化酶（PPO）的活性时应当考虑到pH值的影响，以pH值2.4或pH值7.2时较为适宜。

2.2 温度对PPO活性的影响

试验结果见图2。

图2 温度与PPO相对活性的关系

由图2可知，在0℃～35℃之间，山药中多酚氧化酶（PPO）的活性随温度的升高而增强，35℃时最高；当温度继续上升，即在35℃～65℃之间时，山药中多酚氧化酶（PPO）的活性随温度的升高而下降。温度的变化对酶的活性影响很大，酶的活性在温度下降到20℃以下或升高到50℃以上后显著降低。虽然高温度能抑制多酚氧化酶（PPO）的活性，但考虑对其他营养成的影响，山药贮藏温度选择5℃比较合适。

2.3 混合护色液抑制PPO活性正交试验结果

不同配比EDTA、抗坏血酸与柠檬酸混合护色液对不同切片厚度山药PPO活性抑制正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果

由表2可以看出，影响山药PPO活性各因素的主次为：C＞D＞B＞A，即抗坏血酸质量分数＞柠檬酸质量分数＞EDTA质量分数＞样品厚度；优化的护色条件为A1B1C2D1，即山药切片厚度3 mm、EDTA质量分数0.03%、抗坏血酸质量分数0.4%、柠檬酸质量分数0.5%。由于正交试验中无此试验条件组合，因此还需进行验证性试验。验证试验结果表明，此条件下山药PPO相对活性为18.1%，能较好地抑制山药的酶促褐变。

3 小结与讨论

pH值与温度对山药中多酚氧化酶（PPO）活性的影响研究结果表明，能够有效抑制山药中多酚氧化酶（PPO）活性的pH值应控制在2.4或7.2左右；能够有效抑制山药中多酚氧化酶（PPO）活性的温度应该控制在5℃左右。

采用L9（34）四因素三水平正交试验研究山药的护色条件，优化的护色条件为A1B1C2D1，即将3 mm厚鲜切山药置于EDTA质量分数0.03%、抗坏血酸质量分数0.4%、柠檬酸质量分数0.5%的混合护色液中浸泡3.5 h后，山药片色泽乳白、质地均匀尚好、无褐变现象，能较好地抑制山药的酶促褐变，具有很好的护色效果。