儿童传染性单核细胞增多症不同抗体模式下血浆EB病毒核酸检出率和载量的研究

张书婉,吴 爽,徐 蓓,黄君华

(1西安市儿童医院检验科,西安 710003;2西安医学院医学技术学院;*通讯作者,E-mail:huangjunhua1985@163.com)

EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是一种双链DNA病毒,在人群中有很高的感染率,感染人体后定植于口咽部上皮细胞并以环状DNA的形式游离于血浆中。传染性单核细胞增多症(infectious mononucleosis,IM),简称“传单”,是由EBV引起的儿童原发性急性或亚急性传染病[1],发病率高,症状不典型,常造成误诊。EBV在IM不同时期表达不同抗原,不同机体对抗原应答出不同类型的抗体,所产生的抗体主要有针对病毒衣壳抗原(VCA)的IgM和IgG(VCA-IgM/VCA-IgG)、抗EBV早期抗原的抗体(EBEA-IgG)和抗EBV核抗原的抗体(EBNA-IgG),这导致IM抗体模式复杂多样。目前对IM实验室确诊主要依靠EBV抗体检测和外周血异型淋巴细胞[2],而在不同抗体模式下血浆中EBV检出率和载量是何种情况报道较少。本研究纳入267例诊断为IM的患儿为研究对象,通过EBV抗体检测结果将其分为不同模式并定量检测血浆病毒核酸,以探讨实时荧光定量PCR检测EBV的敏感性及血浆EBV检出率和载量与抗体模式的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取2016-01～2017-12西安市儿童医院收治的267例诊断为IM的患儿为研究对象,其中男158例,女109例,年龄11个月至9岁,平均年龄(3.1±1.2)岁。267例患儿中252例为实验室确诊,15例为临床诊断,确定标准参照中华医学会儿科学分会感染学组、全国儿童EB病毒感染协作组《儿童主要非肿瘤性EB病毒感染相关疾病的诊断和治疗原则建议》[2]。

1.2 方法

1.2.1 标本采集与处理 严格无菌操作采集每位患儿的外周静脉血3 ml于EDTA-K2抗凝管,充分混匀后进行外周血异型淋巴细胞检测;然后将血液标本1 200×g离心10 min分离血浆,每份标本的血浆分装至两支无菌Eppendorf管中4 ℃暂存,其中一份用于抗体检测,一份用于核酸检测。

1.2.2 EBV抗体检测 用ELISA(德国欧蒙公司)检测VCA-IgM,VCA-IgG,EBEA-IgG和EBNA-IgG,严格按照说明书操作。标本吸光度值与标准品吸光度值>1.0判断为阳性。

1.2.3 病毒核酸FQ-PCR EBV核酸扩增试剂盒来自中山达安基因股份有限公司,应用ABI 7300荧光定量PCR仪进行扩增。EBV-DNA>500 拷贝数/ml判读为阳性。

1.3 统计学分析

EBV核酸和VCA-IgM检测阳性率的比较应用配对资料的χ2检验;不同抗体模式下EBV核酸检出率的比较采用多样本率行×列χ2检验Fisher确切概率法;正态性检验应用Kolmogorov-Smirov(K-S)检验,经检验EBV核酸载量不服从正态分布;EBV核酸载量的比较选择多个独立样本组间Kruskal-WallisH检验;应用SPSS 17.0统计软件,P<0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EBV核酸和VCA-IgM检测结果

IM实验室诊断最重要的检测项目为VCA-IgM,因此本研究比较了EBV核酸和VCA-IgM检测阳性率。EBV核酸定量检测(EBV-DNA>500拷贝数/ml)阳性率为89.9%(240/267),高于VCA-IgM的阳性率83.2%(222/267),二者差异有统计学意义(χ2=6.88,P=0.009,见表1)。

表1 267例IM样本EBV核酸与VCA-IgM检测结果比较Table 1 Comparison of positive results of 267 IM samples between EBV-DNA assay and VCA-IgM assay

2.2 不同抗体模式下血浆EBV核酸检出率和载量情况

267例IM患儿均进行了4种抗体(VCA-IgM,VCA-IgG,EBEA-IgG,EBNA-IgG)检测,根据《儿童主要非肿瘤性EB病毒感染相关疾病的诊断和治疗原则建议》[2],所有纳入病例的抗核抗体(EBNA-IgG)均为阴性。其中有15例标本4项抗体检测均为阴性,但外周血异型淋巴细胞≥10%,结合临床指标确定为“临床诊断病例”。其他252例均为“实验室确诊病例”。儿童IM最常见的抗体模式为“VCA-IgM和VCA-IgG阳性”(32.2%)和“VCA-IgM,VCA-IgG和EBEA-IgG阳性”(27.7%),表明主要为早期和急性感染。

不同抗体模式下血浆EBV-DNA检出率的差异无统计学意义(χ2=9.52,P>0.01),但DNA载量的差异有统计学意义(χ2=27.71,P<0.01),急性感染(VCA-IgM,VCA-IgG和EBEA-IgG阳性)时血浆EB病毒载量高于其他感染状态(见表2)。

3 讨论

EB病毒在人群中感染率非常高,约90%以上的成人血液中可检出抗EBV抗体[3],且初次感染后EBV可将病毒基因组整合到B淋巴细胞中建立潜伏感染,因此在无症状人群的单个核细胞中可检出EBV核酸,但血浆病毒DNA为阴性。儿童传染性单核细胞增多症(IM)是由EB病毒引起的原发性感染,属于初次感染EBV,该疾病呈自限性,大多预后良好,但如不及时诊治可能发生噬血淋巴组织细胞增生症等严重并发症。IM的实验室确诊主要依靠EBV抗体检测且以VCA-IgM最为重要[4],但EBV感染后血清学反应复杂多样[5],给IM的诊断造成一定难度。应用FQ-PCR定量检测EBV核酸的方法以其灵敏度高、特异性强、简便快速等优点,成为临床检测EBV的有力工具。虽然DNA检测的敏感度高于抗体检测,但由于不同实验室的操作标准不同等原因,至今仍不是IM确诊的指标之一。本研究纳入267例诊断为IM的患儿为研究对象,定量检测其血浆中的EBV核酸,以探究IM不同抗体模式下血浆病毒DNA的情况,为DNA检测在诊断IM中的应用提供依据。

EB病毒核酸检测的标本来源有外周血单个核细胞和血浆两种,对于IM来说血浆标本更合适[6],因此本研究以血浆为标本类型。在EBV的4种抗体中,以VCA-IgM的敏感度最高[7],与血浆EBV DNA的一致性高[8]。本研究将血浆EBV-DNA和VCA-IgM 的检测结果进行比较,可见核酸检测阳性率为89.9%,VCA-IgM阳性率83.2%,二者差异有统计学意义(P<0.05),说明FQ-PCR较ELISA敏感度高,这与相关研究结论一致[7,9-11],可见核酸检测可提高IM诊断的准确性,有利于EBV感染的早发现早治疗。刘春梅等[9]研究表明荧光定量PCR能够反映患儿体内病毒复制情况,对病情评估、预后和监测具有重要意义。

表2 IM不同抗体模式下血浆EBV-DNA的检出率和载量Table 2 The EBV detection rate and viral loading in different antibody patterns

本研究267例IM样本共有6种抗体模式,其中“VCA-IgM,VCA-IgG阳性”所占比例最高,为32.2%,其次为“VCA-IgM,VCA-IgG,EBEA-IgG阳性”和“VCA-IgM阳性”,说明本院收治病例以早期感染和急性感染为主。不同抗体模式下血浆EBV-DNA检出率的差异无统计学意义(P>0.01),但DNA载量的差异有统计学意义(P<0.01),急性感染(VCA-IgM,VCA-IgG和EBEA-IgG阳性)时血浆EB病毒载量高于其他感染状态。Bauer等[12]研究显示IM患者EBV核酸载量与病程呈负相关,蔡勉珊等[13]的研究认为儿童外周血单个核细胞EBV核酸载量检测有助于病情评估并可预测患儿的临床转归,因此动态监测血浆EBV核酸载量可为IM的诊断、治疗、预后及转归提供依据,但在疾病治疗过程中如何根据核酸定量结果进行判断仍需进一步探讨。

综上所述,血浆EBV-DNA定量检测较抗体检测有更高的灵敏度,二者结合能更好地诊断IM;患儿EBV初次感染后抗体模式多样,主要表现为“VCA-IgM和VCA-IgG阳性”和“VCA-IgM,VCA-IgG和EBEA-IgG阳性”;不同抗体模式下血浆EBV-DNA检出率无差异但核酸载量不同,急性感染时病毒载量较高。