可溶性血管内皮生长因子受体-1、2及其配体等因素在视网膜分支静脉阻塞黄斑水肿中的作用

刘 萍,朱小华

(中南大学湘雅二医院眼科,长沙 410011;*通讯作者,E-mail:liuhandongdd@sina.com)

视网膜分支静脉阻塞属于视网膜血管性疾病之一,好发于中老年人群,主要发病原因为视网膜静脉系统形成血栓所导致视网膜血管性异常[1-3]。视网膜分支静脉阻塞患者的并发症中以黄斑水肿最为常见,严重可导致患者丧失视力。1989年,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)被首次分离提纯,研究发现其在新生血管的形成过程中扮演重要角色,可通过结合其特异性受体,对病理及生理状态下的血管生成产生影响[4,5]。随着研究的不断深入,研究人员指出,VEGF及其受体家族除了参与新生血管形成过程外,还与机体神经功能、心肌缺血以及肿瘤转移等多种生理过程及病理的发生发展相关[6-8]。近年来,康柏西普、贝伐单抗以及雷珠单抗等多种VEGF抑制剂已经逐渐应用于肿瘤的治疗中并取得较好的临床效果,为此,本研究以视网膜分支静脉阻塞伴黄斑水肿患者为研究对象,通过探讨可溶性血管内皮生长因子受体-1(sVEGFR-1)、可溶性血管内皮生长因子受体-2(sVEGFR-2)与该疾病发生发展的相关性,旨在为视网膜新生血管相关疾病的临床治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017-06～2017-12我院就诊的视网膜分支静脉阻塞黄斑水肿患者30例为病例组(n=30),选取同期入院体检的健康人员30例作为对照组(n=30)。根据黄斑水肿程度及范围将30例病例组受试者分为局限性黄斑水肿组(n=10)、弥漫性黄斑水肿组(n=10)、黄斑囊样水肿组(n=10)。入组标准:①符合视网膜分支静脉阻塞诊断标准,且伴黄斑水肿者;②年龄20-45岁,性别不拘;③未曾接受过眼内手术及眼底激光治疗者;④未曾接受过玻璃体腔内注射者;⑤临床资料完整者。排除标准:①其他疾病引起的黄斑水肿患者;②大面积无灌注区及黄斑缺血患者;③存在青光眼病史患者;④严重精神类疾病患者。本研究已经获得医院医学伦理委员会批准,且受试者均已签署书面知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 受试者的分组 根据黄斑水肿程度及范围将30例视网膜分支静脉阻塞黄斑水肿患者分为局限性黄斑水肿组(n=10)、弥漫性黄斑水肿组(n=10)、黄斑囊样水肿组(n=10)。

1.2.2 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法测定血清sVEGFR-1、sVEGFR-2 mRNA水平 PCR扩增条件:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s;65 ℃ 45 s;80 ℃ 5 s,循环39次。溶解曲线:75-95 ℃,增量0.5 ℃,5 s。每次反应均需要设置阴性对照,内参为磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。内参扩增条件为:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s;60 ℃ 30 s;80 ℃ 5 s;循环39次。溶解曲线:75-95 ℃,增量0.5 ℃,5 s。全部引物由TaKaRa公司设计并合成,sVEGFR-1、sVEGFR-2的物序列见表1;应荧光定量PCR仪(型号:BIO-RADCFX96,美国)进行测定,并采用计算机软件对样本的荧光强度进行分析(见表1)。

表1 sVEGFR-1、sVEGFR-2的引物序列Table 1 Primer sequences of sVEGFR-1 and sVEGFR-2

1.2.3 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定血清sVEGFR-1、sVEGFR-2蛋白表达水平 抽取受试者晨起空腹状态下的肘静脉血2 ml,室温条件下静置1 h,采用低温高速离心机以12 000×g的转速条件离心15 min,取上层血清,保存于-70 ℃条件下。采用ELISA法测定血清中sVEGFR-1、sVEGFR-2蛋白水平,操作步骤严格按照说明书进行,ELISA试剂盒购自美国R&D System公司。全部待测样本均设置3个复孔并于同一批次进行测定,最终浓度为三次测定的平均值,批内变异不超过5%,全部检测均由经验丰富的专人进行检测。

1.2.4 观察指标 ①比较局限性黄斑水肿组、弥漫性黄斑水肿组、黄斑囊样水肿组三组受试者性别、年龄等基线资料。②比较病例组、对照组受试者血清sVEGFR-1和sVEGFR-2的mRNA与蛋白表达水平。③局限性黄斑水肿组、弥漫性黄斑水肿组、黄斑囊样水肿组三组受试者血清sVEGFR-1 mRNA和sVEGFR-2 mRNA与蛋白表达水平。④采用Logistic多因素回归分析视网膜分支静脉阻塞黄斑水肿与其血清sVEGFR-1、sVEGFR-2表达水平的相关性。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 三组受试者基线资料

局限性黄斑水肿组、弥漫性黄斑水肿组、黄斑囊样水肿组患者的眼底影像学见图1。局限性黄斑水肿组、弥漫性黄斑水肿组、黄斑囊样水肿组三组受试者年龄、性别等基线资料无显著差异(P>0.05,见表2),故可排除上述因素对研究结果造成的影响,数据具有可比性。

表2 三组受试者基线资料比较Table 2 Comparison of baseline data between three groups of subjects

2.2 病例组、对照组受试者血清sVEGFR-1、sVEGFR-2的mRNA水平以及蛋白表达水平比较

病例组受试者血清sVEGFR-1 mRNA水平和sVEGFR-1蛋白明显高于对照组、血清sVEGFR-2 mRNA水平和sVEGFR-2蛋白明显高于对照组,两组间差异具有统计学意义(P<0.05,见表3)。

表3 病例组、对照组受试者血清sVEGFR-1、sVEGFR-2的mRNA及蛋白水平比较Table 3 Comparison of mRNA and protein levels of serum sVEGFR-1 and sVEGFR-2 in case group and control

2.3 三组受试者血清sVEGFR-1 mRNA、sVEGFR-2 mRNA水平以及sVEGFR-1、sVEGFR-2蛋白表达水平

黄斑囊样水肿组受试者血清sVEGFR-1 mRNA、sVEGFR-2 mRNA以及sVEGFR-1、sVEGFR-2蛋白表达水平明显高于局限性黄斑水肿组、弥漫性黄斑水肿组,弥漫性黄斑水肿组受试者明显高于局限性黄斑水肿组,三组间差异具有统计学意义(P<0.05,见表4)。

表4 三组受试者血清sVEGFR-1、sVEGFR-2 mRNA水平比较Table 4 Comparison of serum sVEGFR-1, sVEGFR-2 mRNA levels between three

2.4 血清sVEGFR-1、sVEGFR-2水平与视网膜分支静脉阻塞黄斑水肿的线性相关分析

线性相关分析结果显示,血清sVEGFR-1蛋白、sVEGFR-2蛋白表达水平与视网膜分支静脉阻塞伴黄斑水肿显著相关(P<0.05,见表5)。

表5 血清sVEGFR-1、sVEGFR-2水平与视网膜分支静脉阻塞伴黄斑水肿的相关性Table 5 Correlation between sVEGFR-1,sVEGFR-2 and retinal branch vein occlusion with macular edema

3 讨论

视网膜分支静脉阻塞患者伴黄斑水肿可对血-视网膜屏障造成损伤,增加机体的血管渗透性,视网膜实质层内渗透进原本处于血浆中的多种蛋白,导致组织缺血缺氧,疾病进一步进展后会损伤视网膜光感受器细胞,且此种伤害是不可逆转的,最终导致患者视功能的严重恶化甚至完全失明[9,10]。因此,探寻视网膜静脉阻塞患者伴黄斑水肿的影响因素,从而采取有针对性的防治措施改善患者视网膜缺血缺氧状态、促进其黄斑水肿的吸收尤为重要。近年来,研究人员提出VEGF在视网膜分支静脉阻塞的发生发展中发挥重要作用,因视网膜分支静脉阻塞患者是由于血液回流所导致的视网膜缺血缺氧状态,患者视网膜内皮细胞中VEGF表达水平增加,对新生血管形成产生影响,从而使得视网膜血管的通透性增加,存在视网膜下的渗液最终可引发黄斑水肿[11-13]。

作为重要的血管内皮细胞促血管生长因子,VEGF的作用包括增加小静脉、微静脉的通透性,并对血管内皮细胞的增殖、分裂以及Ca2+在细胞质内的聚集过程进行促进[14,15]。常见的VEGF受体(VEGFR)主要包括下列三种:VEGFR-1、VEGFR-2以及VEGFR-3,三者同为酪氨酸激酶受体,其中VEGFR-1、VEGFR-2及其相结合的受体可对VEGF的活性进行控制,通过对其受体的自身磷酸化过程进行诱导,使得相关信号转导通路被激活最终发挥生物学活性。sVEGFR-1主要分泌于胎盘合体滋养细胞,由VEGFR-1胞外域剪接而成,具有可分泌性,且对VEGF有高度的亲和力,与sVEGFR-2同为VEGF跨膜受体的可溶形式。sVEGFR-1仅具有胞外配体结合区,缺乏跨膜区以及胞内区,不具备酪氨酸激酶活性[16]。但由于sVEGFR-1还可与VEGFR-1、VEGFR-2相结合,即sVEGFR-1能够对VEGF起到拮抗作用并对其生物学活性进行阻断，sVEGFR-1与VEGF结合后可抑制VEGF促血管生长的作用[17];sVEGFR-2属于VEGF的酪氨酸激酶受体,在血管形成中扮演着主要信号传递体的作用,sVEGFR-2的趋化作用及促有丝分裂活性十分明显,活化后能够导致血管内皮细胞发生分裂、增殖与迁移[18]。sVEGFR-1在先兆子痫、冠状动脉慢血流、糖尿病周围神经病变等多种疾病患者体内表达异常[19,20],而在视网膜分支静脉阻塞黄斑水肿方面未见报道。本文研究发现,视网膜分支静脉阻塞黄斑水肿患者血清sVEGFR-1 mRNA、sVEGFR-2 mRNA含量及其蛋白表达水平明显高于健康人群,通过Logistic多因素回归分析发现,血清sVEGFR-1、sVEGFR-2表达水平与视网膜分支静脉阻塞伴发黄斑水肿显著相关。

视网膜分支静脉阻塞伴黄斑水肿严重程度的影响因素主要包括以下几方面:发病年龄、发生部位、静脉阻塞的类型、黄斑静脉引流影响情况等,患者视网膜分支静脉阻塞的部位与严重程度直接影响到患者视力的预后。视网膜分支静脉阻塞患者血-视网膜内外屏障受损,当病变累及至黄斑区时,细胞外液积在黄斑区视网膜内核层以及Henle纤维间存在,外观为多囊样;同时回流的视网膜内层液体障碍会造成Müller细胞发生肿胀。当黄斑水肿存在较长时间后,可损伤患者黄斑部的解剖结构。相对于弥漫性黄斑水肿及黄斑囊样水肿患者,局限性黄斑水肿患者中心凹处P1波振幅密度更高,提示由此可以看出,相较于局限性黄斑水肿与弥漫性黄斑水肿,黄斑囊样水肿最为严重,且对视功能的损伤最大。本研究中,黄斑囊样水肿组受试者血清sVEGFR-1 mRNA、sVEGFR-2 mRNA、蛋白表达水平明显高于局限性黄斑水肿组、弥漫性黄斑水肿组,弥漫性黄斑水肿组明显高于局限性黄斑水肿组,提示视网膜分支静脉阻塞患者所伴发的黄斑水肿程度越严重,其血清VEGF浓度越高,sVEGFR-1、sVEGFR-2表达水平越高。

综上所述,视网膜分支静脉阻塞黄斑水肿患者血清sVEGFR-1、sVEGFR-2表达水平明显升高,且患者黄斑水肿程度越严重,其血清sVEGFR-1、sVEGFR-2表达水平越高。