槲皮素和芦丁对猪肉肌原纤维蛋白结构的影响

邵晓，张宁，孙乐彤，赵雪，李玲

（临沂大学生命科学学院，山东临沂276000）

肌原纤维蛋白是肉类中含量最高最重要的蛋白质，占总蛋白的55%～60%，是人们日常生活中优质蛋白的主要来源。然而，肉类产品在加工过程中很容易发生蛋白质氧化从而导致产品质量下降，营养价值降低，甚至影响消费者的健康安全[1]。蛋白质氧化会导致蛋白质侧链基团修饰，蛋白质大分子发生交联聚集等，从而影响肉制品的色泽、保水性和口感[2]。因此控制蛋白质氧化，提高蛋白质的凝胶强度是近年来急需解决的首要问题。

多酚是天然植物中的一类生物活性物质，因其抗氧化活性高而广泛应用于食品工业中。近年来关于肉制品中添加酚类化合物的研究也有报道。玫瑰提取物可以阻止牛肉饼中的蛋白质和脂质氧化[3]，500 mg/kg的茶多酚可以降低肉糜制品中脂肪氧化硫代巴比妥酸反应物含量（thiobarbituric acid-reactive substances，TBARS）和蛋白质羰基的含量，降低了肉糜中蛋白的巯基含量，增加了肉糜凝胶的蒸煮损失[4]。低浓度的绿茶提取物能保持肉蛋白结构和氧化稳定性，而高浓度绿茶提取物导致肉的持水力降低，质构变差[5]。酚类化合物既有促氧化又有抑制氧化的效果，取决于酚的种类和浓度，儿茶素、槲皮素和芦丁在高浓度时具有促氧化作用[6]。低浓度绿原酸能有效抑制羰基的生成，适量绿原酸抑制了蛋白质的氧化[7]。低浓度绿原酸使肌原纤维蛋白结构展开，凝胶增强，高浓度绿原酸使蛋白质交联聚集，溶解度下降，凝胶被破坏[8]。芦丁是槲皮素的芸香糖苷，芦丁水解后生成槲皮素，二者都是强抗氧化剂。目前关于槲皮素和芦丁对蛋白质结构的影响几乎没有报道。本研究选用槲皮素和芦丁这两种多酚化合物，研究其在氧化体系中对蛋白质氨基酸侧链结构的影响，为多酚在肉类加工中的实际应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪背最长肌：市售；槲皮素和芦丁（纯度为98%）：临鑫正实验器材有限公司；KCl、MgCl2、乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸 [Ethylenebis（oxyethylenenitrilo）tetraacetic acid，EGTA]、Na2HPO4、NaCl、NaOH、CuSO4、FeCl3、H2O2、HCl、三羟 甲 基氨基甲烷 [tris（hydroxymethyl）methyl aminomethane，Tris]、 乙二胺四乙酸二 钠（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）、二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、酒石酸钾钠、溴酚蓝（bromophenol blue，BPB）、抗坏血酸、甘氨酸、Ellman试剂等（以上试剂均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Allegra 25R高速冷冻离心机：美国Beckman公司；F-4600荧光分光光度计：日本日立公司；H-S4数显恒温水浴锅：金坛市医疗仪器厂；优普UPW系列超纯水器：成都超纯科技有限公司；Spectrum紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纤维蛋白的提取

参考Park等[10]和Feng等[11]的方法并略作修改。在市场上购买最新鲜的猪背最长肌，用刀剔除猪肉上多余的筋膜、脂肪后，将猪肉切成均匀的小块并用绞肉机搅碎后称重，所得的肉糜用于提取猪肉肌原纤维蛋白。称取50 g肉样，加4倍体积的pH 7.0缓冲液匀浆离心，弃上清液，沉淀重复洗涤3遍。沉淀再加入4倍体积的0.1 mol/L NaCl洗液，匀浆离心，弃上清液，重复2次，第3次加洗液匀浆后，用4层纱布过滤以除去结缔组织等，最后用0.1 mol/L HCl调pH值为6.2后离心去上清液，所得膏状物为肌原纤维蛋白。

1.3.2 设计与处理

肌原纤维蛋白用20 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.0）稀释为50 mg/mL，槲皮素和芦丁分别用DMSO配制20 mmol/L的溶液。试管中先加入蛋白溶液，再加入不同量的槲皮素或芦丁溶液，搅拌均匀后加入羟自由基氧化体系（终浓度0.01mmol/L FeCl3、0.1 mmol/L抗坏血酸、10 mmol/L H2O2），4 ℃氧化 12 h。肌原纤维蛋白的终浓度是40 mg/mL，槲皮素或芦丁的终浓度分别是0、0.1、0.2、1、2 mmol/L。氧化反应通过添加 EDTA 终止（终浓度1 mmol/L）。以未加槲皮素、芦丁和氧化剂的蛋白溶液作为空白对照组。

1.4 物理化学性能的测定

游离巯基含量采用DTNB法进行测定[12]。将样品用甘氨酸缓冲溶液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L甘氨酸，4 mmol/LEDTA，pH 8.0）缓冲溶液稀释至 1 mg/mL，吸取 1.5 mL，加入 15 μL Ellman 试剂，振荡放置 1 h，使之充分反应，离心（12 000 g，10 min）后取上清液，在412 nm处测定吸光度。

疏水性测定采用溴酚蓝结合法进行，参照Chelh等[13]描述的方法将肌原纤维蛋白用20 mmol磷酸盐缓冲溶液稀释为5 mg/mL的蛋白溶液。取1 mL加入0.2 mL的1 mg/mL溴酚蓝（BPB），充分混匀，离心用上清液在595 nm测定吸光值。

二聚酪氨酸含量参考李学鹏等[14]方法，利用F-4600荧光分光光度仪测定吸光度，激发波长选择325 nm，发射波长为420 nm，狭缝宽度均为10 nm，灵敏度为2。

内源色氨酸荧光的变化通过F-4600荧光分光光度仪进行检测。用20 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 6）将样品稀释为蛋白浓度0.1 mg/mL，吸取0.1 mL置于石英比色皿中，室温条件下283 nm激发，记录下300 nm～400 nm的发射光谱供后续分析。

1.5 统计分析

用SPSS 18.0统计软件进行单因素方差分析和Duncan’s进行多重比较。所有试验重复进行3次。结果表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 多酚对猪肉肌原纤维蛋白中游离巯基含量的影响

多酚对氧化体系中肌原纤维蛋白游离巯基含量的影响见图1。

图1 多酚对氧化体系中肌原纤维蛋白游离巯基含量的影响Fig.1 Effect of polyphenols on the free sulfydryl of myofibrillar protein under oxidation conditions

从图1中可以看出，添加槲皮素后，肌原纤维蛋白游离巯基的含量与对照组差异不显著（p＞0.05）。然而芦丁与槲皮素不同，芦丁具有提高游离巯基的作用。1 mmol/L和2 mmol/L芦丁组的游离巯基含量显著高于对照组（p＜0.05）。芦丁有效抑制了蛋白质氧化，在添加量为1 mmol/L和2 mmol/L时，随着浓度的上升，游离巯基含量显著升高，高浓度多酚对氧化体系中肌原纤维蛋白侧链基团有保护作用。李玲等[7]前期对绿原酸抑制肌原纤维蛋白氧化研究中发现，随着绿原酸浓度的增加，游离巯基和总巯基含量增加，与该研究结果一致。而在研究草鱼肌原纤维蛋白冻藏过程中的变化时，发现随冷冻时间的延长，总巯基和游离巯基含量逐渐降低[15]。而本研究中，芦丁使巯基含量增加，而槲皮素作用效果不显著，其原因可能与氧化剂与抗氧化剂的浓度比例不同有关，还有抗氧化剂的结构基团与其功效存在一定的构效关系。

2.2 多酚对猪肉肌原纤维蛋白表面疏水性的影响

多酚对氧化体系中肌原纤维蛋白表面疏水性的影响见图2。

图2 多酚对氧化体系中肌原纤维蛋白表面疏水性的影响Fig.2 Effect of polyphenols on the BPB content of myofibrillar protein under oxidation conditions

由图2可知，添加槲皮素和芦丁后，能显著增加肌原纤维蛋白的表面疏水性。随着槲皮素的增加，肌原纤维蛋白的疏水性呈上升趋势，其中0.2 mmol/L～2 mmol/L组与对照组和0.1 mmol/L组差异显著（p＜0.05）。随着芦丁含量的增加，肌原纤维蛋白的疏水性也呈上升趋势，与槲皮素组的变化趋势一致。高浓度的多酚进一步促进了蛋白结构的展开，更多疏水性氨基酸暴露在蛋白分子表面[16]，疏水性增加。有研究表明，在肌原纤维蛋白中添加不同浓度的没食子酸，疏水性会持续增加，高浓度没食子酸作用效果更明显，与该试验结果一致，多酚促进了蛋白质结构的展开[17]。

2.3 多酚对猪肉肌原纤维蛋白二聚酪氨酸含量的影响

多酚对氧化体系中肌原纤维蛋白二聚酪氨酸含量的影响见图3。

图3 多酚对氧化体系中肌原纤维蛋白二聚酪氨酸含量的影响Fig.3 Effect of polyphenols on the dityrosine of myofibrillar protein under oxidation conditions

随着槲皮素的增加，肌原纤维蛋白的二聚酪氨酸含量呈下降趋势。槲皮素添加1 mmol/L和2 mmol/L组与对照组差异显著（p＜0.05），说明槲皮素具有抑制蛋白质侧链氨基酸的聚合作用，可以降低二聚酪氨酸的含量。而0.1 mmol/L和0.2 mmol/L组与对照组差异不显著（p＞0.05），说明低含量的槲皮素抑制氨基酸聚合作用的效果较差。随着芦丁含量的增加，肌原纤维蛋白的二聚酪氨酸含量也呈下降趋势，与槲皮素组的变化趋势一致。说明槲皮素和芦丁都具有抑制蛋白质侧链氨基酸的聚合作用，保护蛋白质免受氧化攻击。酪氨酸对羟自由基很敏感，易被氧化发生聚合反应而生成二聚酪氨酸。有研究发现肌原纤维蛋白氧化后二聚赖氨酸含量增加[18]。有人在研究两种自由基氧化大黄鱼肌原纤维蛋白时均发现，随氧化剂浓度的升高，二聚酪氨酸含量显著增加[19]。有研究在肌原纤维蛋白中添加一定浓度的鞣酸或没食子酸，能抑制二聚酪氨酸含量的增加[20]。这是因为抗氧化剂酚类物质在氧化体系中普遍能够起到清除自由基的作用，保护蛋白质侧链基团，进而维持蛋白质的空间结构[21-22]。

2.4 多酚对猪肉肌原纤维蛋白内源色氨酸荧光强度的影响

槲皮素对氧化体系中肌原纤维蛋白内源色氨酸荧光强度见图4。

蛋白质氧化处理后，随着槲皮素含量的增加，内源色氨酸荧光强度逐渐降低。特别是在高浓度时，这可能是由于MP结构的进一步展开以及槲皮素与色氨酸残基的相互作用引起的。槲皮素又名五羟黄酮，其羟基具有金属离子螯合剂或油脂等氧化过程中产生的游离基团接受体的功能，可作为油脂、抗坏血酸的抗氧化剂。

芦丁对氧化体系中肌原纤维蛋白内源色氨酸荧光强度见图5。

图4 槲皮素对氧化体系中肌原纤维蛋白内源色氨酸荧光的影响Fig.4 Effect of quercetin on tryptophan fluoescence of myofibrillar protein under oxidation conditions

图5 芦丁对氧化体系中肌原纤维蛋白内源色氨酸荧光的影响Fig.5 Effect of rutinum on tryptophan fluoescence of myofibrillar protein under oxidation conditions

随着芦丁添加量的增加，内源色氨酸荧光强度逐渐降低，2 mmol/L组荧光强度最低，这与槲皮素的添加效果一致。芦丁是槲皮素的芸香糖苷，芦丁水解后生成槲皮素。二者在结构上有共同处，在影响色氨酸内源荧光强度的变化趋势上一致。与此类似，绿原酸和没食子酸也具有降低肌原纤维蛋白内源色氨酸荧光强度的作用[7-8，23]。

3 结论

在氧化体系中，不同浓度的槲皮素和芦丁可以有效抑制猪肉肌原纤维蛋白的氧化。芦丁可以增加游离巯基含量，而槲皮素在此浓度范围内，对游离巯基含量影响不大。槲皮素和芦丁都具有增加肌原纤维蛋白表面疏水性，降低二聚酪氨酸和内源色氨酸荧光值的作用。由此可见，多酚对自由基引起的氧化起到一定的抑制作用。可以通过向肉制品中添加一定量的多酚化合物防止蛋白质氧化。