毕赤酵母对酸粥风味品质形成的评价

折米娜，王玉荣，刘康玲，张振东，双全，*

（1.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.湖北文理学院食品科学技术学院，鄂西北传统发酵食品研究所，湖北襄阳 441053）

酸粥是一种流行于陕北、晋北以及内蒙古西部地区的传统发酵食品[1]，其原料为糜米、大米、小米和糯米等，通过自然发酵而成[2]。由于其制作环境相对开放[3]，可能会由于环境中的氧气、温度和微生物等作用在发酵过程中发生水解或氧化反应，进一步分解为酯、醛和醇等化合物[4]，严重影响其风味品质，从而导致酸粥产业化生产受到一定程度的限制。其中影响酸粥风味品质的一个重要因素是微生物[5]。有研究发现在泡菜发酵的过程中，毕赤酵母属酵母的大量繁殖会使其表面有白膜产生并带有一定的恶臭味[6]，而李文亚[7]等在酸粥中也分离出毕赤酵母菌，并且证实其全程参与酸粥的发酵。然而关于毕赤酵母菌对酸粥风味品质影响的研究还没有文献报道。

气味是消费者对食品新鲜度及可接受度的重要感官指标之一[8]。目前食品中挥发性风味物质的测定主要通过电子鼻和气相色谱-质谱联用（gas chromatography and mass spectrometry，GC-MS） 技术来实现。电子鼻又称气味扫描仪，是一种模拟动物嗅觉器官开发的高科技产品[9]。其利用气体传感器阵列的响应图案来识别敏感气味，能快速识别样品中的挥发性成分，具有响应时间短、检测速度快和误差小等优点[10]，在乳制品[11]、肉制品[12]、果蔬制品[13]和茶类[14]等方面有着广泛的应用。气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）是一种结合气相色谱和质谱的特性对食品中挥发性成分进行定量和定性检测分析的方法[15]，在咖啡[16]、橄榄油[17]和红酒[18]等方面都有研究报道。

本研究以分离自内蒙古巴彦淖尔市酸粥中的酵母菌与乳酸菌为试验对象，通过单一菌株发酵和复配发酵相结合的手段进行酸粥样品的制备。采用电子鼻结合气相色谱-质谱联用技术对毕赤酵母发酵酸粥中挥发性风味物质的种类及含量进行分析，同时结合多元统计学方法探讨毕赤酵母对发酵酸粥风味品质的影响，以期为后续酸粥品质改善和产业化生产提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

糜米：市售；菌株：由内蒙古农业大学食品科学与工程学院民族特色食品研发团队提供；葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、乙酸钠、酵母粉、柠檬酸二铵、磷酸氢二钾、七水合硫酸镁、一水合硫酸锰和吐温80均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司。

LXJIIB低速大容量多管离心机：上海安亭科学仪器厂；KH-100DY超声波清洗机：昆山禾创超声仪器有限公司；PEN3电子鼻：德国Airsense公司；GCMSQP2020气相色谱质谱联用仪、SH-Rtx-Wax（30 m×2.25 mm×0.25 μm）色谱柱：岛津企业管理（中国）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 酸粥的制作工艺

将糜米进行淘洗并沥干，加入3倍体积的蒸馏水置于65℃水浴30 min。待温度降至室温（25℃～28℃）后接种微生物菌株进行酸粥的发酵。其中乳酸菌组与酵母菌组以接种量为5%（体积分数）分别接入乳酸菌和酵母菌，复配组分别接种2.5%（体积分数）乳酸菌与酵母菌。各组酸粥于30℃发酵30小时后煮沸，置于4℃备用。菌株信息如表1所示。

表1 菌株信息Table 1 The information of strains

1.2.2 基于电子鼻技术对酸粥挥发性风味品质评价

取酸粥样品15 mL置于50 mL顶空瓶中，待样品温度为室温后，进行电子鼻测定。测定条件：进样时间为5 s，采样时间为60 s，自动清洗时间为90 s，每个样品测定3次，取平均值。电子鼻各传感器信息如表2所示。

表2 电子鼻传感器及对应敏感化学物质Table 2 The electic nose sensors and their corresponding sensitive material types

1.2.3 基于GC-MS对酸粥挥发性风味物质品质评价

1.2.3.1 样品前处理

取各酸粥样品6 mL于20 mL顶空样品瓶，立即用带有聚四氯乙烯铝帽夹紧封，备用。测试采用捕集肼模式，将样品置于60℃，保温30 min，进样量为1 μL，进样口解析5 min后，进入GC-MS分析。

1.2.3.2 GC条件

色谱柱：SH-Rtx-Wax-5ms（30 m×2.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：200 ℃；进样方式：分流进样；分流比：8∶1；载气为高纯氮气；流速为1 mL/min；程序升温：起始温度40℃，保持3 min，以5℃/min升至50℃，保持10 min，继续以6℃/min升至130℃，不保持，最后以10℃/min升至200℃，保持7 min。

1.2.3.3 MS条件

离子源温度：250℃；接口温度：280℃；离子化方式：EI；电子能量：70 eV；质量扫描范围：33～450（m/z）；采集方式：Q3 Scan。

1.2.3.4 定性分析

NIST14标准质谱库定性；保留指数定性。

1.2.3.5 定量分析

利用峰面积对样品中主要组分进行相对含量分析。

1.3 数据处理

使用主成分分析（principal component analysis，PCA）、典范对应分析（canonical correspondence analysis，CCA）、马氏距离（mahalanobis distance）和多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）对酸粥挥发性风味物质差异性进行分析；使用冗余分析（redundancy analysis，RDA）对与酸粥挥发性风味物质整体结构差异显著相关的指标进行分析；使用配对t检验对酸粥主要挥发性风味物质进行显著性分析。除RDA采用Canoco4.5软件外，其余分析均采用Matlab 2010b 软件 （The Math Works，Natick，MA，USA）、Origin8.5软件（OriginLab，MA，USA）作图。

2 结果与分析

2.1 基于多元统计学方法的不同菌株发酵酸粥挥发性物质的评价

研究首先采用电子鼻技术对各酸粥样品的挥发性风味物质进行分析，利用主成分分析（PCA）对3组酸粥样品间挥发性风味物质进行分析。其PCA因子载荷图如图1所示。

由图1可知，通过PCA分析发现，3组发酵酸粥的挥发性风味物质主要集中在前两个主成分。其中第一主成分贡献率为88.92%，包括W1C、W3C、W5C、W1S、W2S、W5S、W2W传感器，通过表2可知主要包括芳香化合物、烷烃类、氮氧化合物和有机硫化物等化合物。第二主成分贡献率为7.24%，其主要由是W6S和W3S传感器组成，包括氢气和甲烷。

本研究进一步使用典范对应分析（CCA）对3组发酵酸粥的风味品质进行分析。基于CCA分析不同菌株发酵酸粥风味品质评价如图2所示。

由图2可知，3组发酵酸粥在空间排布上呈现出连续性且存在明显分离。其中乳酸菌组集中在左侧，而其余两组酸粥主要集中在右侧。结合图1因子载荷图可以发现，导致乳酸菌组与其他两组酸粥存在差异性的挥发性风味物质可能是具有芳香的化合物。本研究进一步使用马氏距离聚类方法对各组酸粥样品的风味品质进行差异性分析。基于马氏距离不同菌株发酵酸粥风味品质评价如图3所示。

图1 不同菌株发酵酸粥风味品质PC1和PC2因子载荷图Fig.1 Graphical representation of the principal component analysis of the flavor quality of different strain fermentated sour porridge

图2 基于CCA不同菌株发酵酸粥风味品质评价Fig.2 Canonical correspondence analysis of the flavor quality of different strain fermentated sour porridge

图3 基于马氏距离的不同菌株发酵酸粥风味品质评价Fig.3 The cluster analysis of the flavor quality of different strain fermentation sour porridge based on Mahalanobis distance

由图3可知，酵母菌组与复配组酸粥聚为一类，而乳酸菌组酸粥为一类，从而可知酵母菌组和复配组酸粥的风味品质差异较小，而与乳酸菌组酸粥差异较大。进一步使用MANOVA多元统计分析方法对3组酸粥的整体挥发性物质差异性分析发现，酵母菌组与复配组酸粥的气味呈现出差异不显著（P＞0.05），而与乳酸菌组酸粥呈现出差异极显著（P＜0.001），由此认为不同菌株发酵酸粥样品间的挥发性风味物质存在一定的差异性。

2.2 基于冗余分析的不同菌株发酵酸粥挥发性物质的评价

本研究进一步使用冗余分析（RDA）对3组发酵酸粥的挥发性风味物质进行评价，结果如图4所示。

图4 RDA双序图Fig.4 Biplot of the RDA

由图4可知，传感器W1C、W3C和W5C指标在RDA排序约束轴上呈现良好相关，则认为对上述传感器所敏感的化学物质代表了发酵酸粥整体风味差异显著相关的主要挥发性风味物质。由图4亦可知，上述三类传感器位于乳酸菌组一侧，结合表2可知，W1C敏感的化学物质为芳香化合物，W3C敏感的化学物质为芳香化合物，W5C敏感的化学物质为烷烃和芳香化合物。综上所述，导致乳酸菌组与其他两组酸粥挥发性风味物质存在差异的主要风味物质是具有芳香的化合物。

2.3 基于GC-MS技术对不同菌株发酵酸粥挥发性风味物质的评价

本研究进一步使用GC-MS技术对各组酸粥样品中挥发性风味物质进行了定性和相对定量分析，其测得各组挥发性风味物质平均相对含量结果如表3所示。

表3 酸粥样品中挥发性组分及相对含量Table 3 The volatile components and relative content in sour porridge samples %

根据GC-MS数据显示，30个发酵酸粥中共检测到162种挥发性风味物质。其中酯类化合物37种，烷烃类化合物53种，醇类化合物17种，醛类化合物18种，酮类化合物10种，酸类化合物10种，胺类化合物4种，其他类化合物12种。由表3可知，酯类和醇类化合物为酸粥样品主要挥发性化合物，其平均相对含量均大于20%，而烷烃类化合物种类较多，但是各化合物平均相对含量较低。在众多挥发性物质中有5种化合物的平均相对含量大于5%，利用配对t检验方法对5种挥发性化合物进行差异性分析，如图5所示。

图5 挥发性化合物显著性分析Fig.5 The analysis of the significance of volatile compounds

由图5可知，5种挥发性风味物质分别为乙酸乙酯、DL-丙氨酸乙酯、己醛、3-甲基-1-丁醇和乙醇。通过配对t检验发现，乙酸乙酯和乙醇在3组发酵酸粥中表现出显著性差异（P＜0.01），己醛和3-甲基-1-丁醇表现出极显著差异（P＜0.001）。而DL-丙氨酸乙酯表现出无显著性差异。由图5亦可知，乳酸菌与酵母菌进行复配发酵后，乙酸乙酯、己醛和3-甲基-1-丁醇等化合物的含量上升。乙酸乙酯具有低毒性，含量低时有果香味，同时具有强烈的醚似的刺激性气味[19]，乙醇具有特殊香味并伴有刺激的辛辣滋味。而己醛主要来自ω-6不饱和脂肪酸，具有清新的青草香，但是含量高时会有酸败和令人作呕的气味[20-21]，3-甲基-1-丁醇有特殊不愉快气味，同时还有辛辣而令人厌恶味。由此可知，乳酸菌单一发酵酸粥中乙酸乙酯、己醛和3-甲基-1-丁醇的平均相对含量较低，使酸粥的风味可以被大众接受，而毕赤酵母单一发酵与复配发酵3种化合物的含量均会提升，都会严重影响到酸粥的品质。据文献报道，部分酵母菌可以在食物表面大量繁殖，并且产生肉眼可见的白色菌膜并引起食物发生变色或变质现象[22]。目前在乳品[23]、肉品[24]以及果蔬[25]等中均发现毕赤酵母，而此类酵母菌在发酵过程中产生的代谢产物在一定程度上具有潜在致病性[26]。在酸粥发酵过程中，毕赤酵母菌发酵会有膜醭生成且伴有不愉快的气味，由此看出添加毕赤酵母菌发酵后对酸粥的风味品质影响较大。

该试验进一步利用典范对应分析（CCA）对5种挥发性风味物质进行有监督空间排布，基于CCA分析不同菌株发酵酸粥代表性挥发性化合物品质评价如图6所示。

图6 基于CCA不同菌株发酵酸粥代表性挥发性化合物品质评价Fig.6 Canonical correspondence analysis of the representative volatile compounds quality evaluation of different strain fermentated sour porridge

由图6可知，3组发酵酸粥在空间排布上呈现出明显的分离趋势。其中乳酸菌组发酵酸粥集中在右侧，而其余两组酸粥集中在左侧，这与试验得出结论相符合。综上所述，认为乳酸菌发酵酸粥挥发性风味物质与酵母菌组和复配组发酵酸粥存在显著差异，其造成差异的主要挥发性风味物质为3-甲基-1-丁醇、己醛、乙酸乙酯和乙醇。

3 结论

本研究选用分离自内蒙古巴彦淖尔市酸粥中毕赤酵母和乳酸菌为研究对象，通过单一菌株发酵和复配发酵相结合的手段进行酸粥的制备，同时采用电子鼻结合GC-MS技术对酸粥中的挥发性风味物质进行评价。研究发现，毕赤酵母单独发酵及其与乳酸菌复配发酵制备的酸粥挥发性风味物质无显著差异，而与乳酸菌发酵酸粥有显著差异，加之毕赤酵母在酸粥发酵过程中表面常形成白膜且具有一定的致病性，因而毕赤酵母对酸粥风味品质形成无积极影响。通过本研究的实施对后续酸粥发酵剂的制备及酸粥的产业化发展提供了一定理论参考。