二氧化硫抗氧化能力及其在干果中的含量分析

汪荷澄，蒲云峰

（1.塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300；2.阿拉尔质量技术监督综合检测检验所，新疆阿拉尔843300）

新疆拥有丰富、优质的果品资源，是我国主要的干果产区。据2017年《新疆统计年鉴》报道，新疆的红枣、葡萄、苹果、梨、杏、桃和枸杞的产量分别为326.4万吨、267.6万吨、136.6万吨、128.0万吨、119.8万吨、17.6万吨和5.2万吨，其中红枣、葡萄、杏和枸杞常用于干制加工。在前期的干果品质分析中，发现枸杞、黄提、吊干杏及小无花果的抗氧化能力非常高，枸杞、黄提、吊干杏及小无花果的氧自由基清除能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC） 分别为 143.04、74.21、76.16、60.02 μmol TE/g DW，而被认为抗氧化能力高的黑加仑的ORAC仅为67.82 μmol TE/g DW。此外，绿珍珠是由无核白葡萄阴干的绿色葡萄干[1]，其ORAC值为46.70 μmol TE/g DW，仅为黄提ORAC的62.30%。然而，在这些干果中，总酚含量最高的是干制骏枣（6.73 mg GE/g DW），其次是干制灰枣（5.35 mg GE/g DW）；总黄酮含量最高的是黄提（3.04 mg RE/g DW），其次是吊干杏（2.78 mg RE/g DW）和黑加仑（2.77 mg RE/g DW）。枸杞和吊干杏中除富含酚酸和黄酮外，还含有丰富类胡萝卜素[2-3]，类胡萝卜素也具有较强的抗氧化能力，或许能解释它们的抗氧化能力强。虽然在所分析的干果中，黄提和小无花果中总黄酮最高，但它们的总酚含量并不高（黄提和小无花果的总黄酮分别为 1.67、1.63 GE/g DW）。

二氧化硫及其盐类常被作为漂白剂、防腐剂和抗氧化剂[4]，常常被应用于葡萄酒、果酒、果蔬干制、鲜果保鲜、果脯、中药材等中[1，3，5-6]，对抑制微生物生长，防止酶促褐变[7]，延长货架期均具有重要作用[8-9]。在干果加工中，为了抑制酶促褐变和非酶褐变，常常采用1 000 mg/L～4 000 mg/L的二氧化硫熏蒸处理。无花果、杏干、黄提等干果的色泽浅，贮藏过程中褐变会导致色泽加深，影响产品外观质量，因此，这类干果加工中可能采用了二氧化硫熏蒸处理。

二氧化硫是已知的抗氧化剂，虽然有文献报道二氧化硫能够还原过氧化氢和邻醌类化合物[10-11]，但还未见关于二氧化硫抗氧化能力（二苯代苦味酰基自由基 （1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨盐自由基（2，2-diamine-（3-ethyl benzothiazolin-6-sulfonic acid）diammonate，ABTS）、铁离子还原能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）和氧自由基清除能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）的研究报道。然而，在食品抗氧化分析中，DPPH、FARP、ABTS和ORAC是常用的4种抗氧化能力分析方法[12]。因此，本文配制不同浓度的二氧化硫溶液，分析其抗氧化能力（DPPH、FARP、ABTS和ORAC），然后测定几种新疆常见干果的二氧化硫含量，以期更好地理解二氧化硫的抗氧化能力和干果的营养价值。

1 材料与方法

1.1 材料

8个干果样品（黄提、绿珍珠、黑加仑、小无花果、大无花果、骏枣、吊干杏、枸杞）：阿拉尔市干果市场。每个样品约500 g，切块后（骏枣和吊干杏需去核后再切块），经液氮处理后迅速粉碎，然后装袋置于-20℃备用。

1.2 试剂

6-羟基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid，Trolox）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，4，6-三吡啶基三嗪 [2，4，6-Tri（2-pyridyl）-S-triazine，TPTZ]、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2'-amino-di（2-ethylbenzothiazoline sulphonic acid-6）ammonium salt，ABTS]、偶氮二异丁脒盐酸盐[azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride，AAPH]、荧光素：阿拉丁试剂（上海）有限公司；其他化学试剂均为分析纯试剂。

1.3 仪器

UV-2550分光光度计：日本岛津公司；1510酶标仪、374酶标仪、微孔板振荡器：美国Thermo Fisher公司；HE53水分分析仪：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 抗氧化能力

DPPH参考Anna等[13]的方法稍作修改，取20 μL样液于96孔板，再加入200 μL DPPH溶液，在300 r/min速度下振荡30 min后，在517 nm处测定吸光值，用Trolox作为标准物质，结果以μmol TE/g DW表示。

ABTS参考Anna[13]的方法稍作修改，2mL2.6mmol/L过硫酸钾与2 mL 7.4 mmol/L ABTS+·混合后，室温避光放置16h，然后用无水乙醇稀释至0.70±0.02（734 nm）。取 20 μL 样液于 96 孔板，再加入 200 μL ABTS+·溶液，在300 r/min速度下振荡10 min，然后在734 nm测定吸光值，用Trolox作为标准物质，结果以μmol TE/g DW表示。

FARP参考Kriensak等[12]的方法稍作修改，0.3mol/L乙酸钠缓冲液、20 mmol/L FeCl3和10 mmol/L TPTZ按照10∶1∶1（体积比）的比例混合，即为FARP使用液；取20 μL样液于96孔板，再加入200 μL FRAP溶液，在300 r/min速度下振荡10 min，然后在593 nm测定吸光值，用Trolox作为标准物质，结果以μmol TE/g DW表示。

ORAC参考Du等[14]的方法稍作修改，取20 μL样液至96孔板，再加入20 μL荧光素溶液，在300 r/min速度下振荡5 min，再加200 μL AAPH溶液启动反应。荧光激发波长和发射波长分别为485 nm和538 nm，每2分钟测定一次荧光强度。用Trolox作为标准物质，结果以μmol TE/g DW表示。

1.4.2 干果中二氧化硫（SO2）的测定

参考GB5009.34-2016《食品安全国家标准食品中二氧化硫的测定》。称取5 g均匀样品，置于蒸馏烧瓶中。加入250 mL水，装上冷凝装置，冷凝管下端插入预先备有25 mL乙酸铅吸收液的三角瓶的液面下，然后在蒸馏瓶中加入10 mL盐酸溶液，立即盖塞，加热蒸馏。当蒸馏液约200 mL时，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1 min。用少量蒸馏水冲洗插入乙酸铅溶液的装置部分。同时做空白试验。

向取下的三角瓶中依次加入10 mL盐酸、1 mL淀粉指示液，摇匀之后用碘标准溶液滴定至溶液颜色变蓝且30 s内不褪色为止，记录消耗的碘标准溶液滴定体积，然后计算样品中二氧化硫含量。

1.5 数据分析

每个处理重复3次，结果以平均值±标准差表示，并采用SPSS20.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

以 6-羟基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）为标准物质，分别建立了DPPH、FARP、ABTS和ORAC的标准曲线，见表1。

表1 DPPH、FARP、ABTS和ORAC的标准曲线Table 1 The standard curves of DPPH，FARP，ABTS and ORAC

由表1可以看出，在试验浓度范围内，Trolox抗氧化能力的线性关系良好。

2.2 二氧化硫的抗氧化能力

为了测定二氧化硫的抗氧化能力，以亚硫酸钠配置浓度为 0.01、0.05、0.10、0.20 mg/mL 的样液（浓度以二氧化硫计），然后参照1.4.1的方法测定其抗氧化能力，每个处理重复3次，结果见图1。

图1 二氧化硫的抗氧化能力Fig.1 The antioxidant activities of sulfur dioxide

从图1来看，采用4种抗氧化分析方法，不同浓度的二氧化硫均具有一定的抗氧化能力。在试验浓度范围内，二氧化硫浓度与抗氧化能力呈线性关系，它们的相关系数为 R2ORAC=0.998 4＞R2FARP=0.994 5＞R2ABTS=0.859 3＞R2DPPH=0.805 9，其中采用ORAC法分析的线性关系尤为明显。此外，在相同二氧化硫浓度下，采用ORAC法测定的结果显著高于其他3种分析方法（P＜0.05）。例如：以0.2 mg/mL二氧化硫分析时，采用DPPH、FARP、ABTS和ORAC法测定获得抗氧化能力分别为0.1488、0.1208、0.2003μmolTE/mL和0.3812μmolTE/mL。从现有结果来看，证实了采用DPPH、FARP、ABTS和ORAC法分析抗氧化时，二氧化硫（亚硫酸钠水溶液）具有一定的抗氧化能力，其抗氧化能力在1 μmol Trolox/mg～2 μmol Trolox/mg范围内。这说明当样品中含有二氧化硫，采用DPPH、FARP、ABTS和ORAC法测定抗氧化能力时，样品抗氧化能力测定结果会偏高。

2.3 干果中二氧化硫含量

鉴于二氧化硫会导致抗氧化能力增加，那么新疆常见干果中是否含有二氧化硫及其含量高低，就成了本文期望了解的另一个问题。参照1.4.2的方法测定了干果中的二氧化硫含量，结果见图2。

图2 新疆8种典型干果中二氧化硫含量Fig.2 The sulfur dioxide contents of 8 kinds of dried fruits in Xinjiang

由图2可以看出，黄提、枸杞、大无花果、吊干杏和小无花果中检出二氧化硫，而骏枣、绿珍珠和黑加仑中未检出。根据GB2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》的规定，水果干类的二氧化硫最大使用量为0.1 g/kg（只限用于熏蒸，最大使用量以二氧化硫残留量计）。黄提和枸杞中二氧化硫残留分别为1.45、0.18 g/kg DW，说明黄提和枸杞中二氧化硫超标。大无花果、吊干杏和小无花果中的二氧化硫分别为0.07、0.05、0.05 g/kg DW，其残留量在国家食品安全标准范围内。

二氧化硫能萃取因O2还原产生的过氧化氢，通过这种方式抑制醛类的产生和易氧化化合物的氧化[15]。此外，二氧化硫还能将醌类还原成其相应的酚类，实现了葡萄酒中酚类的再生[16]。那么，黄提中总酚、总黄酮和抗氧化能力远高于其同类干果（绿珍珠），或许可由其含有过量二氧化硫来解释。由于枸杞、吊干杏、大无花果和小无花果也含有一定量二氧化硫，它们的酚类及抗氧化能力也会受影响。从现有结果来看，二氧化硫可能是导致部分干果抗氧化能力异常的主要原因，或许可通过测定样品的抗氧化能力来判断样品是否含有二氧化硫。

3 结论

本文采用DPPH、FARP、ABTS和ORAC法分析了二氧化硫的抗氧化能力，证实了二氧化硫（亚硫酸钠水溶液）具有抗氧化能力，且抗氧化能力与浓度呈线性相关，其中以ORAC法的抗氧化能力最好。通过干果中二氧化硫含量测定，发现5种干果含有二氧化硫，其中黄提和枸杞的二氧化硫含量超过了国家食品安全限量标准，尤其是黄提中二氧化硫达到1.45 g/kg DW。从现有结果来看，二氧化硫可能是部分干果抗氧化能力异常的主要原因。因此，在干果或其它可能使用二氧化硫的样品品质分析时，应考虑二氧化硫对相关指标的影响，才能客观评价其营养及功能价值。