高效液相色谱法测定面条中过氧化苯甲酰的含量

孟 霞，丁腊梅，周 帅，阮晓玲

（长沙医学院药学院，湖南长沙 410219）

过氧化苯甲酰（BPO）是面粉中常见的添加剂，能抑制面粉中一些微生物生长，增强面筋弹性和增加面粉的白度，起到漂白和防止霉变的作用[1]，常被称为面粉增白剂。BPO具有很强的氧化性，性质极不稳定，在面条加工的过程中绝大部分会水解成苯甲酸，其对面食具有后熟作用[2]，但苯甲酸超过限度可能导致肝、肾脏损害[3]，影响人体健康。我国食品标准GB 2760中规定了小麦粉中过氧化苯甲酰的限度为0.06 g/kg[4-5]，卫法监发[2001]159号文，以及国家质量监督检验检疫总局发布的GB/T 18415—2001均规定了面粉中过氧化苯甲酰的检验方法。我国已于2011年撤销过氧化苯甲酰作为食品添加剂的许可，严禁在面粉生产中添加过氧化苯甲酰，同时加强了小麦及其产品的监督力度，以保障该类食品的食用安全。

目前，过氧化苯甲酰的检测方法包括化学分析法、光谱法[6]、色谱法[7-8]和质谱法[9]等，其中化学分析法和光谱法由于灵敏度较低，不适用低限度过氧化苯甲酰的检测。食品标准和多数文献研究均采用高效液相色谱法对面粉及面食产品中的过氧化苯甲酰进行测定，该法又分为直接法和间接法，但是过氧化苯甲酰化学性质不稳定，易分解生成苯甲酸，将样品中过氧化苯甲酰还原为苯甲酸后，采用间接法测定过氧化苯甲酰更为可靠。

试验采用HPLC法测定面条中过氧化苯甲酰含量，将过氧化苯甲酰分解为苯甲酸，通过测定面条中苯甲酸的量间接测定过氧化苯甲酰的含量。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-P600型依利特液相色谱仪、AL204型分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司产品；KQ-300E型超声仪，昆山超声仪器有限公司产品。

过氧化苯甲酰标准品（99.0%，B802244-250 g）、苯甲酸标准品（＞98%，B20085-250 g），甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），磷酸（85%），超纯水，硫代硫酸钠（分析纯），面条。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱Hedera-C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；采用乙腈-0.04%磷酸（42∶58，V∶V） 作为流动相；流速为1.0 mL/min；检测波长235 nm，进样量为20μL。

1.2.2 苯甲酸和过氧化苯甲酰对照品溶液

精密称取苯甲酸和过氧化苯甲酰对照品各约10 mg，分别置于10 mL容量瓶中，用适量甲醇溶解并稀释至刻度，再分别精密移取0.1 mL置于10 mL容量瓶中，用流动相定容，摇匀即得10.0μg/mL的对照品储备液。

1.2.3 供试品溶液

精密称取8.0 g粉碎后的面条粉末，置于25 mL容量瓶中，加入10 mL无水乙醇，再加入1.0 mL 10%Na2S2O3溶液，超声时间15 min，放置5 min后用流动相定容至刻度，混合均匀，静置，取上清液用微孔滤膜（0.45μm）滤过，备用。

1.2.4 色谱图

过氧化苯甲酰对照品溶液见图1，苯甲酸对照溶液见图2。

由图1和图2可知，过氧化苯甲酰在常规前处理过程中会分解为苯甲酸，很难直接测定面条中的过氧化苯甲酰。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

精密移取苯甲酸对照品储备液适量，分别配制质量浓度为0.1，0.3，1.0，5.0，10.0μg/mL苯甲酸对照品溶液，分别精密吸取上述溶液20μL，注入液相色谱仪中，记录峰面积。以苯甲酸对照品溶液质量浓度（μg/mL） 为横坐标、苯甲酸峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y=16 332X+2 512.4，R2=0.999 7，结果表明苯甲酸的质量浓度在0.1～10.0μg/mL的线性关系良好。

图1 过氧化苯甲酰对照品溶液

图2 苯甲酸对照溶液

2.2 精密度

取面条粉末8.0 g，精密称量，置于25 mL容量瓶中，精密移取0.25 mL 10.0μg/mL过氧化苯甲酰对照溶液，然后按照“供试品溶液配制”项下方法进行处理，精密吸取上述溶液20μL进样分析，连续进样6次。

精密度试验结果见表1。

表1 精密度试验结果

分析计算可得，测得的样品中苯甲酸质量浓度均值为0.105μg/mL（相当于0.33 mg/kg），乘以系数0.992（MBPO），即样品中过氧化苯甲酰含量为0.104μg/mL（相当于0.32 mg/kg），RSD为5.21%，样品精密度符合要求。

2.3 准确度

取湖南某公司生产的面条，粉碎后称取约8.0 g置于25 mL容量瓶中，制备9份，分别加入0.25，0.75，2.50 mL过氧化苯甲酰对照品储备液（10.0μg/mL），每个质量浓度水平配制3份，按“样品制备”项方法制备低、中、高3个质量浓度水平的加样回收率样品溶液，相同色谱条件下测定。

加样回收率试验结果见表2。

表2 加样回收率试验结果

2.4 LOD和LOQ

以信噪比（S/N） 为3和10分别计算检测限和定量限，过氧化苯甲酰的最低检出限和定量限分别为0.03μg/mL和0.1μg/mL。

2.5 稳定性

配制0.1μg/mL过氧化苯甲酰溶液和苯甲酸对照溶液，2份溶液分别放置0，0.5，1.5，3.0，5.0，8.0，10.0，12.0 h后进样分析，记录色谱峰面积，二者的RSD分别为1.31%和1.68%，表明2种溶液在12 h内基本稳定。

2.6 样品测定

分别取3个不同厂家的面条，按“供试品溶液项”下制备样品溶液，分别进样分析。3个公司生产的面条均不含过氧化苯甲酰添加剂，产品合格。

样品测得结果见表3。

表3 样品测得结果

3 讨论

3.1 样品前处理

与之前的研究报道相比，试验样品的取样量增加较多，对前处理方法进行了优化，文献报道的前处理方法包括振荡、涡旋和超声[10-12]等，比较这3种前处理方法对过氧化苯甲酰生产苯甲酸的转化率，称取8.0 g面条粉末，分别制备含有0.1μg/mL和10.0μg/mL的过氧化苯甲酰样品溶液进行考查，加入相同量的硫代硫酸钠溶液，常温条件下反应时间也相同。

3种前处理方法过氧化苯甲酰的转化率结果比较见表4。

由表4可知，硫代硫酸钠溶液与过氧化苯甲酰反应，超声的前处理方法比涡旋和振荡的转化率明显要高，超声处理15 min后，反应时间对过氧化苯甲酰的转化率的影响不大，最终选择过氧化苯甲酰与硫代硫酸钠溶液在常温条件下超声处理15 min作为试验前处理方法。

表4 3种前处理方法过氧化苯甲酰的转化率结果比较

3.2 Na2S2O3用量

称取8.0 g面条粉末，分别制备含有0.1μg/mL和10.0μg/mL的过氧化苯甲酰样品溶液，其中分别加入不同体积（0.5，1.0，1.5，2.0 mL） 的10%硫代硫酸钠溶液进行还原，通过比较过氧化苯甲酰生成苯甲酸的转化率，最终选择1.0 mL 10%硫代硫酸钠溶液作为还原剂。

3.3 过氧化苯甲酰的限度

我国食品添加剂使用卫生标准GB 2760—1996规定了过氧化苯甲酰在小麦粉中的限度为0.06 g/kg[4-5]；许秀敏等人[13]采用HPLC同时测定小麦粉及其制品中过氧化苯甲酰和苯甲酸，BPO的检出限可达到0.10 mg/kg；张艳等人[14]采用高效液相色谱法同时测定面粉中的过氧化苯甲酰和苯甲酸，BPO的最低检出限为0.14 mg/kg；邢文[15]在小麦粉中过氧化苯甲酰检测色谱法改进中，BPO的检出限为0.005 g/kg；晏龙等人[10]在HPLC法测定面粉中曲酸和过氧化苯甲酰的含量中，BPO的检出限为0.5μg/g；试验也采用HPLC法测定面条中过氧化苯甲酰的含量，最低检测限为0.093 7 mg/kg，远远低于食品添加剂使用卫生标准的0.06 g/kg，也低于其他文献报道的限度，方法灵敏度更高，适用于面条中低限度过氧化苯甲酰含量的测定。

4 结论

研究针对不同生产厂家加工的面条，通过优化样品前处理条件，建立了间接测定面条中过氧化苯甲酰的高效液相色谱方法。该方法操作简单快捷、灵敏度和准确度高，适用于实际工作中面条中过氧化苯甲酰的测定，方法具有一定的优势。