苜蓿蛋白抗氧化肽的研究

韩雅利，高丹丹，马洪鑫，余 琼，李明生

（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 700124）

生物活性肽是由2～20种氨基酸通过肽键连结而成一类化合物，具有抗氧化、免疫促进、激素调节、抗菌抗病毒，以及降血压和降血脂等生理功能[1]。近年来，生物小分子以其分子量小、易吸收、活性高等特点越来越受到人们的青睐，其中抗氧化肽更成为研究的热点之一[2]。目前，引起人类机体衰老的重要原因是氧化作用的这一观点已被证实，而自由基则是引起氧化作用的关键因素。自由基极不稳定，可与膜中的不饱和脂肪酸进行反应，生成过氧化产物，在一定的条件下，又可分解成更多的自由基，引起一系列的连锁反应，从而导致细胞、线粒体、DNA等广泛损伤[3]，造成衰老和恶性肿瘤等多种疾病。

苜蓿，是一种多年生豆科草本植物[4]，全国的种植面积已达130×104hm2，因其产量高、营养丰富、适口性好为人们所喜食，被誉为“牧草之王”[5]。目前，国内酶解植物蛋白制备抗氧化活性多肽的研究已经全面展开[6]。现已报道，抗氧化活性肽的植物蛋白源有大豆蛋白、小麦谷蛋白、玉米蛋白、碎米蛋白等，而苜蓿活性肽至今还未开发，国内外大部分苜蓿主要用于动物饲料，少量停留在对苜蓿蛋白提取及其营养成分分析上，其水解后的蛋白肽活性和功能机理却未见研究。因此，对苜蓿活性肽类产品的研究与开发就具有十分重要的意义。试验以苜蓿叶为原料，经过提取、水解蛋白后制得抗氧化肽，以多肽物对自由基的清除率、金属离子的螯合率和其还原能力为指标，筛选出最佳抗氧化肽水解用酶，为苜蓿蛋白的高效利用和有效开发提供理论依据，提高苜蓿的生物附加值，促进西北地区的经济发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苜蓿叶，甘肃省榆中县西北民族大学生命科学与工程学院植物培育场提供；胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶，北京中生瑞泰科技有限公司提供；胰蛋白酶、DPPH自由基，Sigma公司产品；福林酚，深圳市康初源有限公司提供；三氯乙酸（TCA）、氯化亚铁、过氧化氢（30%）、氢氧化钠、盐酸、邻二氮菲、邻苯三酚（没食子酚）、菲咯嗪、铁氢化钾等试剂，兰州银河化工原料有限公司提供。

表1 5种不同蛋白酶酶解反应条件

1.2 仪器与设备

JA2003N型电子精密天平，上海菁海仪器有限公司产品；HI8424型便携式防水型酸度计，上海东原仪器厂产品；冷冻干燥机；干燥箱；722E型可见光分光光度计；HWS26型电热恒温水浴锅，河南兄弟仪器设备有限公司产品；H2050R型台式高速冷冻离心机，湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司产品；LGJ-10型真空冷冻干燥机，北京松原华兴科技发展有限公司产品；JJ-2型组织捣碎机，金坛杰瑞尔仪器公司产品。

1.3 方法

1.3.1 二次加热提取苜蓿蛋白

摘取苜蓿叶，将苜蓿叶清洗、烘干，放入组织搅碎机中打成粉末备用。在苜蓿粉中按照一定的料液比加入蒸馏水，放入50℃恒温水浴锅中水浴1 h，用纱布过滤后，滤液置于85℃恒温水浴锅中50 min，取出后，封装于离心管中进行离心，弃去上清液，得到湿蛋白，再将其冷冻干燥，制得蛋白粉备用，放入-20℃条件下保存。

1.3.2 酶解液的制备

取5 g苜蓿蛋白粉，溶于100 mL水中，配成5%的溶液。在保持酶活力相等的情况下，将5份样液中分别加入不同量的胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶，同时调节各个酶的最适pH值，并置于其最适温度下进行水解。在酶解的过程中要不断用1 mol/L氢氧化钠或盐酸进行调节，使得pH值的幅度为0.5之间，酶解4 h后，将混合液于90℃水浴加热灭酶15 min，放置冷水下冲洗进行快速冷却，冷却后添加同量10%的三氯乙酸，充分混匀后，在常温条件下以转速10 000 r/min，离心15 min，沉降酶类物质、未酶解的苜蓿蛋白以及其他杂质，留取上清液，置于冷冻条件下保存备用。

5种不同蛋白酶酶解反应条件见表1。

1.3.3 苜蓿抗氧化肽活性测定

（1） DPPH·清除能力测定。取1 mL苜蓿蛋白水解液，按照相同体积加入0.2 mmol/L DPPH·溶液（95%无水乙醇为溶剂配制），然后加人2.0 mL的水混合均匀，避光处反应30 min后，于波长517 nm处测定其吸光度，每组做3个平行，以95%乙醇代替蛋白水解液和DPPH·溶液做空白试验[7-10]。按以下公式计算DPPH·的清除率为：

式中：A0——95%乙醇代替样品所测得的吸光度；

A1——酶解液的吸光度；

A2——95%乙醇代替DPPH·所测得的吸光度。

式中：A0——Tris-HCl代替酶解物所得吸光度；

A1——酶解液的吸光度。

（3） 羟自由基清除能力测定[14]。分别在装有1 mL的蛋白水解液的5个试管中加入1.5 mL PBS缓冲液，再分别加入1.5 mL 1,10-菲啰啉（0.75 mmol/L） 和FeSO4溶液，摇匀，待其37℃恒温水浴锅中充分反应30 min后，将试液置于比色皿中，于波长536 nm处测定各管的OD值，为A1；以蒸馏水代替试液，再加入0.01%的H2O2，此溶液为A2；用相同体积的H2O代替H2O2溶液，其他条件不变，此溶液为A0。羟自由基（·OH）清除率的计算公式如下：

（4） 金属离子螯合能力测定[15]。取酶解液1 mL于试管中，加入氯化亚铁溶液0.1 mL、菲咯嗪溶液0.2 mL和水2.5 mL，摇匀，将样液置于避光处充分反应10 min，于波长562 nm处测其OD值。调零管A0：水代替酶解液所测吸光度；A1管：水代替氯化亚铁溶液。按如下计算Fe2+螯合率：

（5）还原能力测定。参考文献[16]的方法并略作改动，1 mL酶解液中加入2.5 mL PBS缓冲液、2.5 mL 1%铁氰化钾，将其放入50℃恒温水浴锅中反应20 min后取出，使其冷却，再分别加入10%TCA，混匀反应体系，以转速5 000 r/min离心10 min，取上清液，在5支试管中分别添加0.1%三氯化铁1 mL，水5 mL，于波长700 nm处测吸光度进行比较。

2 结果与分析

2.1 DPPH·清除能力分析

据研究报道，DPPH·溶于无水乙醇后，可形成紫色溶液，由于其组分颜色较深，具有最高吸光度，于波长517 nm处可测定。当DPPH·遇到抗氧化物质时，其分子结构中的未成对电子开始进行自由配对，形成黄色溶液，颜色变浅，吸光度降低，因此可利用吸光度的变化程度来判定多肽液的抗氧化能力[17]，吸光度越高，则证明试液对自由基的清除效果越好，抗氧化活性也就越高。

5种不同蛋白酶水解液DPPH·清除率的比较见图1。

图1 5种不同蛋白酶水解液DPPH·清除率的比较

由图1可知，5种蛋白酶水解苜蓿蛋白所得的多肽液均对DPPH·有清除能力，其中胰蛋白酶水解物的清除率最好，明显优于其他蛋白酶水解物，为80.63%±1.65%，碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解物的清除率分别为67.90%±1.72%，70.30%±1.93%，67.71%±1.51%，胃蛋白酶水解物清除效果稍差，为60.20%±1.64%。

2.2 超氧阴离子自由基清除能力分析

超氧阴离子为造成人体损伤的一种主要自由基，主要来源于体系中黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶的反应，以邻苯三酚自氧化反应模拟体系产生，利用反应过程中形成的有色中间产物来判断的清除能力。研究发现，该有色物质在波长325 nm有最大吸光度，加入蛋白多肽液后能够抑制中间有色产物生成，使得该组分的吸光度降低。

图2 5种不同蛋白酶酶解液清除率的比较

2.3 羟自由基（·OH）清除能力分析

羟自由基具有强氧化性，易对人体细胞造成损伤，使其生物结构发生变化。原理是反应系中的Fe2+能与1,10-菲啰啉结合形成红色化合物，在可见光波长536 nm处有最高吸收值，而羟自由基可使体系中的Fe2+氧化成Fe3+，使吸光度降低，吸光度与羟自由基（·OH） 含量成正比，因此，可用吸光度来评价酶解物羟自由基（·OH） 的清除率。

5种不同蛋白酶酶解液对·OH清除率的比较见图3。

图3 5种不同蛋白酶酶解液对·OH清除率的比较

由图3可知，5种蛋白酶水解物均有清除羟自由基（·OH）的能力，其中木瓜蛋白酶的清除作用最为显著，达到37.60%±2.02%，胰蛋白酶水解物清除能力为22.30%±1.60%，胃蛋白酶、碱性蛋白酶以及中性蛋白酶的清除效果不佳，分别为14.90%±1.68%，16.15%±1.80%，17.40%±1.87%。

2.4 金属离子（Fe2+）螯合能力分析

Fe2+为过渡金属离子，可催化体内强氧化物质生成，造成人体生理功能紊乱。利用Fe2+作为自由基引发剂来评价金属离子的螯合能力，Fe2+遇到菲啰嗪会形成红色复合体，其在波长562 nm处有强吸收，而受试物中的螯合剂，则会阻碍该复合体形成，使吸光度发生变化。

5种不同蛋白酶酶解液对Fe2+螯合率的比较见图4。

由图4可知，5种不同蛋白酶酶解苜蓿蛋白得到的物质对金属离子（Fe2+）都有较好的螯合能力，其中尤其以木瓜蛋白酶酶解液最佳，为96.10%±2.06%，胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶水解液的清除能力分别为95.10%±1.70%，84.60%±1.79%，93.47%±1.81%，94.50%±1.98%。

图4 5种不同蛋白酶酶解液对Fe2+螯合率的比较

2.5 不同多肽液还原能力的分析

酶解液的还原能力可作为衡量其抗氧化性指标的原因是：还原能力强的物质通过为自由基提供电子配对形成稳定的物质，来达到终止自由基反应的目的。试验通过将反应液中的Fe3+还原成Fe2+，测定波长700 nm处的吸光度变化判断其还原能力的强弱[18]，试液的还原能力越强，则表明其抗氧化性越好。

5种不同蛋白酶酶解液还原能力的比较见图5。

图5 5种不同蛋白酶酶解液还原能力的比较

由图5可知，5种样液均具有还原能力，由大到小依次为木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶＞碱性蛋白酶＞中性蛋白酶＞胃蛋白酶。

3 结论

由于酶具有专一性的特点，不同的蛋白酶可能只对某些肽键或带有某种基团的氨基酸作用，因此使用不同的蛋白酶酶解得到的多肽种类及其抗氧化性也存在差异[19]。经综合分析，试验中的木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解苜蓿蛋白制得的抗氧化肽活性最好，具有较高的还原能力，并且对DPPH·、超氧阴离子（O2-·）、羟自由基（·OH） 的清除能力和螯合Fe2+的能力都要强于中性蛋白酶、碱性蛋白酶和胃蛋白酶的酶解产物，是酶解苜蓿蛋白的最优酶，但是据相关研究报道，木瓜蛋白酶可降解植物细胞壁中的壳聚糖，而壳聚糖具有降血脂、降血糖的作用，且木瓜蛋白酶比胰蛋白酶可分解更多、更广泛的蛋白底物，易造成多肽产品的不纯净、单一。因此，确定胰蛋白酶为苜蓿抗氧化多肽的最佳酶解用酶。