应用大孔树脂分离纯化管花肉苁蓉中苯乙醇苷研究

刘朋龙， 王 亮

（1.新疆天润生物科技股份有限公司，新疆乌鲁木齐 830088；2.新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐 830046）

管花肉苁蓉（Cistanchetubulosa（Schenk）Wight）为列当科肉苁蓉属、多年生寄生草本植物，在医药上主要是用其根部[1]。管花肉苁蓉别名为南疆大芸、管花大芸、红柳大芸，其茎入药，具有补精血、益肾壮阳、润肠通便的效用，被称之为“沙漠人参”[2]。肉苁蓉的主要药用成分为苯乙醇苷类物质[3]。由于苯乙醇苷有的较高的应用价值，管花肉苁蓉苯乙醇苷类成分的提取、分离纯化都具有显著意义。

大孔树脂是一类不溶于酸、碱和各种有机溶剂的有机高聚物吸附剂，因其具有选择性好、操作简单、适用范围广、树脂可再生等特点，在很多领域都有广泛的应用[4]。近年来，大孔吸附树脂天然药物纯化应用较为广泛，是分离纯化中药有效成分的一种行之有效的方法[5]。

试验在前期提取管花肉苁蓉苯乙醇苷研究的基础上，应用AB-8型大孔树脂分离纯化管花肉苁蓉苯乙醇苷，确定了最佳的纯化工艺，为管花肉苁蓉苯乙醇苷的分离纯化提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

管花肉苁蓉苯乙醇苷提取液，实验室自制；AB-8型大孔树脂，常熟理工学院提供；氢氧化钠、盐酸、丙酮、乙醇，均为分析纯。

1.1.2 仪器

HK-20B 1000 g摇摆式高速中药粉碎机，广州市旭朗机械设备有限公司产品；CW-2000型超声-微波协同萃取仪（固定频率40 kHz，功率50 W），上海新拓分析仪器科技有限公司产品；ME204E型电子分析天平（0.000 1 g），深圳市盛美仪器有限公司产品；Z-326K型台式冷冻离心机，靖江市新大机电设备制造有限公司产品；THZ-82型恒温振荡器，常州国华电器有限公司产品；UV-2450PC型紫外可见分光光度计，上海胜斯贸易有限公司产品；冷冻干燥机，宁波生化仪器有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 管花肉苁蓉中苯乙醇苷提取及含量测定

（1）管花肉苁蓉中苯乙醇苷提取。将新疆管花肉苁蓉粉碎，过80目筛，按照丙酮体积分数50%，料液比1∶14（g∶mL），微波功率100 W进行提取，抽滤去上清液，以转速3 000 r/min离心10 min，取上清液，减压浓缩，冷冻干燥2 d，得到肉苁蓉苯乙醇苷类物质备用。

（2）管花肉苁蓉中苯乙醇苷含量测定[6]。在前期研究基础上得到松果菊苷标准曲线为Y=0.008 6X-0.022 7，R2=0.997 4。根据松果菊苷标准曲线建立的回归方程计算管花肉苁蓉中苯乙醇苷含量，然后按公式（1）计算出苯乙醇苷得率：

1.2.2 管花肉苁蓉苯乙醇苷的粗纯化

将管花肉苁蓉中苯乙醇苷提取液进行浓缩，将浓缩液与无水乙醇按照1∶9的比例醇沉，于4℃条件下静置过夜；离心过滤，除去沉淀，旋转蒸发，除去有机试剂，得到管花肉苁蓉苯乙醇苷，备用[7]。

1.2.3 大孔树脂预处理

将AB-8型大孔树脂颗粒充分溶胀后再用95%乙醇继续冲洗直到冲洗液无白色或褐色浑浊为止，然后继续用蒸馏水洗至中性；再用5%盐酸溶液浸泡12 h，用蒸馏水洗至中性，最后用2%的氢氧化钠溶液浸泡12 h，蒸馏水洗至中性备用[8-11]。

1.2.4 AB-8型大孔树脂对管花肉苁蓉苯乙醇苷静态吸附动力学研究

（1）管花肉苁蓉苯乙醇苷浓度对吸附效果的影响。取2 g处理过的大孔树脂若干份于100 mL带塞锥形瓶中，分别加入原液稀释5，10，15，25倍浓度的管花肉苁蓉苯乙醇苷提取液50 mL，将锥形瓶置于恒温振荡器中，于25℃，以转速200 r/min振荡24 h，测定吸附过后提取液的质量浓度，平行3次，按照公式（2） 和公式（3）[12]，计算吸附率，以吸附率和吸附量为纵坐标，绘制大孔树脂吸附曲线图。

式中：C1——吸附前滤液质量浓度，mg/mL；

C0——吸附后滤液质量浓度，mg/mL；

V——加入样液和乙醇体积，mL。

（2）时间对吸附效果的影响。取2 g处理过的大孔树脂，加入吸附最佳的管花肉苁蓉苯乙醇苷提取液质量浓度置于恒温振荡器中，于25℃条件下，以转速200 r/min振荡，每隔1 h测定1次质量浓度，测3组平行样，计算吸附率，直至吸附饱和为止。以时间为横坐标、吸附率为纵坐标，绘制大孔树脂吸附曲线图。

（3）时间对解析效果的影响。将预处理好的大孔树脂2 g若干份于100 mL带塞锥形瓶中，各自加入50mL吸附最佳的管花肉苁蓉苯乙醇苷提取液，置于恒温振荡器中，于25℃条件下，以转速200 r/min振荡，每隔1 h测定1次质量浓度，测3组平行样，计算解析率按公式 （4），直至解析率基本不变为止。

式中：C1——吸附前滤液质量浓度，mg/mL；

C0——吸附后滤液质量浓度，mg/mL；

C2——解析后滤液质量浓度，mg/mL。

1.2.5 AB-5型大孔树脂对管花肉苁蓉苯乙醇苷动态吸附试验

（1） 上样流速对吸附效果的影响。准确称取5份预处理好的AB-8型大孔树脂，采用乙醇湿法装柱（3 cm×30 cm），树脂填装高度为200 mm，将原样进行上样，流速分别为1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 BV/h，对上样流速进行考查，以上样流速为横坐标、管花肉苁蓉苯乙醇吸附率为纵坐标作图。

（2） 解析剂体积分数对解析效果影响。上述（1.2.5（1）） 管花肉苁蓉苯乙醇苷完全吸附后，分别用20%，30%，40%，50%，70%的乙醇进行洗脱，流速为2 BV/h，流出液每1 BV收集1份，分别测定管花肉苁蓉苯乙醇苷的质量浓度，直至样液中的管花肉苁蓉苯乙醇苷完全被洗脱下来为止，以乙醇体积分数为横坐标、管花肉苁蓉苯乙醇苷解析率为纵坐标作图。

（3）洗脱流速对吸附效果的影响。管花肉苁蓉苯乙醇苷提取液在大孔树脂中完全吸附后，用50%的乙醇以不同的洗脱速率1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 BV/h进行洗脱，并绘制解析曲线，选取最佳洗脱速度，以洗脱速率为横坐标、管花肉苁蓉苯乙醇苷解析率为纵坐标作图。

1.2.6 管花肉苁蓉苯乙醇苷纯度计算

将纯化好的管花肉苁蓉苯乙醇苷提取液测定管花肉苁蓉苯乙醇苷的质量浓度，冷冻干燥并烘干至恒质量，按照公式（5）[13]进行计算。

式中：C——纯化后管花肉苁蓉苯乙醇苷质量浓度，mg/mL；

n——稀释倍数；

V——样液体积，mL；

M——纯化后管花肉苁蓉苯乙醇烘干质量，g。

2 结果与分析

2.1 AB-8型大孔树脂对管花肉苁蓉苯乙醇苷静态吸附试验结果

2.1.1 管花肉苁蓉苯乙醇苷质量浓度对吸附效果的影响

管花肉苁蓉苯乙醇苷质量浓度对吸附量和吸附率的影响见图1。

图1 管花肉苁蓉苯乙醇苷质量浓度对吸附量和吸附率的影响

由图1可知，管花肉苁蓉苯乙醇苷质量浓度在不断升高的同时，吸附量也在不断升高，吸附率却在一直降低，这表明在质量浓度增大的时候，管花肉苁蓉苯乙醇苷的含量增多，吸附量随着增大，但由于达到了树脂吸附的饱和状态，不能够被完全吸附，质量浓度越大，不被吸附的含量就会越大，吸附率就会降低。因此，为了保证吸附量最大又不浪费管花肉苁蓉苯乙醇苷，此次研究选用最佳管花肉苁蓉苯乙醇苷质量浓度为1.2 mg/mL。

2.1.2 吸附时间对吸附效果的影响

吸附时间对吸附率的影响见图2。

图2 吸附时间对吸附率的影响

由图2可知，随着吸附时间的延长，吸附率也不断的升高，在0～1 h时升高的速率最快，树脂吸附达到了饱和状态，随后增长缓慢，基本保持不变，这是因为随着吸附时间不断延长，树脂达到了吸附饱和状态，为了提高试验的效率，选择最佳吸附时间为1.5 h。

2.1.3 吸附时间对解析效果影响

吸附时间对解析率的影响见图3。

图3 吸附时间对解析率的影响

由图3可知，随着吸附时间的延长，解析率也在不断的升高，在0～4 h时，解析速率最快，随后增长缓慢，直至基本保持不变。这是因为随着吸附时间不断延长，被吸附的管花肉苁蓉苯乙醇苷被完全解析。因此，此次选择最佳的吸附时间为4 h。

2.2 大孔树脂对管花肉苁蓉苯乙醇苷的动态吸附试验结果

2.2.1 上样流速对吸附效果的影响

上样流速对吸附率的影响见图4。

图4 上样流速对吸附率的影响

由图4可知，随着上样流速的增大，吸附率不断降低。这是由于在动态吸附过程中，吸附率流速快慢与树脂对管花肉苁蓉苯乙醇苷吸附效果直接相关。上样液的流速越慢，样液中的管花肉苁蓉苯乙醇苷与树脂接触的时间越长，大孔树脂就可以吸附更多的管花肉苁蓉苯乙醇苷，但是流速过慢，会使生产周期延长，生产效率降低。为了提高工业生产的效率，又要保证对吸附率大小的影响较小，因此选择上样流速为1.5 BV/h。

2.2.2 乙醇体积分数对解析效果的影响

乙醇体积分数对解析率的影响见图5。

由图5可知，随着乙醇体积分数的增大，解析率不断升高，在20%～40%时解析速率最快，之后基本保持不变。在实际生产中，为了更大限度地节省生产成本，最佳洗脱的乙醇体积分数为40%。

2.2.3 洗脱流速对解析效果的影响

洗脱流速对解析效果的影响见图6。

图5 乙醇体积分数对解析率的影响

图6 洗脱流速对解析率的影响

由图6可知，随着洗脱流速的增大，解析率先增大再降低，最后基本保持不变。在1.0～1.5 BV/h时解析率最快，解析率在一直增加；随后在1.5～2.5 BV/h时解析率在不断地降低，2.5～3.0 BV/h时解析率基本保持不变。这可能是因为洗脱速率不断增大，使得洗脱液不能与树脂完全接触，不能使其完全解析。因此最佳的洗脱流速为1.5 BV/h。

2.3 管花肉苁蓉苯乙醇苷纯度计算结果

将AB-8型大孔树脂纯化后的洗脱液收集100 mL，取少量测定质量浓度，计算其总含量，再将其浓缩放入冷冻干燥机中干燥，称质量，并计算其纯度，得到其纯度达到80%，纯化前为42.5%，比纯化前增加了37.5%。

3 结论

应用AB-8型大孔树脂分离纯化管花肉苁蓉苯乙醇苷，其最优工艺为上样液质量浓度1.2 mg/mL，上样流速1.5 BV/h，吸附时间1.5 h，解析时间4 h，洗脱的乙醇体积分数40%，洗脱流速1.5 BV/h。收集洗脱液，减压浓缩后冷冻干燥，得到管花肉苁蓉中苯乙醇苷的初步纯化物，其纯度达到80%，纯化前纯度为42.5%，比纯化前增加了37.5%。此次研究在一定程度上实现了管花肉苁蓉苯乙醇苷的分离纯化，为其今后研究提供一定的理论依据。