酶解制备鱼鳞蛋白降血压肽的工艺优化

涂 丹 张益奇 叶 繁 戴志远

(1浙江工商大学海洋食品研究院，浙江杭州 310035；2浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室，浙江杭州 310035)

目前，治疗高血压的化学合成降压药物有卡托普利、依那普利等，这些药物的降血压效果显著，但需要长期服用，且有一定的副作用，如引起咳嗽、丧失味觉、肾脏损伤等[1-2]，因此，研发更加安全、高效的降压药物，对高血压的预防和治疗显得尤为必要。血管紧张素转换酶(angiotension converting enzyme，ACE)是一种膜结合的含锌二肽羧基肽酶。它能够催化血管紧张素Ⅰ转化成具有强烈血管收缩作用的血管紧张素Ⅱ，同时能使具有血管扩张作用的缓激肽失活，导致血压上升[3-5]。因此，通过抑制ACE的活性，减少血管紧张素Ⅱ的生成，能够降低血压。ACE抑制肽因具有与血管紧张素Ⅰ相似的结构，能够与ACE结合位点结合，竞争性抑制血管紧张素Ⅱ的合成，从而起到降低血压的作用[6]。天然来源的ACE抑制肽因具有安全性高、易吸收、无副作用等特点，受到人们广泛关注[7]。目前，酶法降解是制备ACE抑制肽的最主要的方式，酶解制得的ACE抑制肽因具有安全性高、毒副作用小且可长期使用而备受关注。

鱼鳞是水产品加工过程中产生的废弃物，占到鱼体重的1%～5%，含有丰富的蛋白质(约占鱼鳞的50%～70%)，但并未得到很好的开发利用。据不完全统计，我国每年废弃的鱼鳞达30万t[8]，造成了极大的资源浪费和环境污染。目前，采用鱼源蛋白制备ACE抑制肽的研究，多以鱼皮为原料[9-10]，而以鱼鳞为原料制备ACE抑制肽及其纯化、结构分析等方面也已经开展了一系列工作。与鱼皮相比，鱼鳞结构更为致密，其丰富的Ⅰ型胶原主要分布在鱼鳞内层，外层被羟基磷灰石覆盖，这些抗性屏障使得鱼鳞难以被降解，通常需要加大酶使用量(6%左右)[11-12]或延长酶解周期[13]制备胶原蛋白肽。故针对生物活性肽的制备工艺进行优化，以提高其制备效率，是一项有价值的工作。

热处理通过改变鱼鳞蛋白的结构进而影响其酶解进程，因而也可能会改变蛋白酶酶解的最优条件。前期研究发现121℃处理15 min可显著提高鱼鳞的酶解效率。为获得更多ACE抑制肽，本研究以罗非鱼鱼鳞为原料，对鱼鳞进行适当的高温预处理，以鱼鳞酶解产物水解度和ACE抑制率为评价指标，在单因素试验的基础上对酶解工艺参数进行响应面试验优化，确定制备酶解鱼鳞蛋白ACE抑制肽的最佳工艺条件，进一步探究最优酶解条件下制得的酶解产物的相对分子质量分布情况，以期为深入开发鱼鳞蛋白资源、利用鱼鳞制备胶原蛋白肽提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗非鱼鱼鳞(蛋白质含量55.87%)，湛江环球水产有限公司；碱性蛋白酶(alcalase 3.0T，标称活力为3.0 AU·g-1)、中性蛋白酶(neutral protease，标称活力为0.8 AU·g-1)、复合蛋白酶(protemax，标称活力为1.5 AU·g-1)、风味蛋白酶(flavourzyme，标称活力为500 LAPU·g-1)，均购自诺维信(中国)生物技术有限公司；胰蛋白酶(trypsin，标称活力为250 000 U·g-1)、马尿酸(hippuric acid，HA)、马尿酰-组氨酰-亮氨酸(N-hippuryl-histidyl-leucine，HHL)、血管紧张素转换酶(ACE)、邻苯二甲醛(o-Phthalaldehyde，OPA)、丝氨酸(Ser)、抑肽酶、细胞色素C、碳酸酐酶、杆菌肽等均购自美国Sigma公司。

1.2 主要仪器与设备

400Y多功能粉碎机，永康市铂欧五金制品有限公司；DGG-9123A电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；DSHZ-300A旋转式恒温振荡器，太仓市实验设备厂；Fresco 21冷冻高速离心机，美国Thermo Fisher公司；QL-8bb-253旋涡振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；EVOLUTION 60S紫外分光光度计，美国Thermo Fisher公司；e2695高效液相色谱，美国Waters公司；K-360凯氏定氮仪、K-425快速消解仪，瑞士BUCHI公司；MLS-3781L高压灭菌锅，日本Panasonic公司。

1.3 试验方法

1.3.1 鱼鳞前处理 将新鲜鱼鳞用清水冲洗，沥干，用0.4%氢氧化钠溶液浸泡12 h(料液比为1∶5 g·mL-1)，除去脂肪、杂蛋白等，然后用1%HCl溶液浸泡，料液比为1∶10 g·mL-1，搅拌2 h进行脱钙处理，再用流水冲洗3 h，置于60℃恒温烘箱烘烤24 h，最后粉碎即得脱钙鱼鳞粉(蛋白质含量62.13%)，塑封袋保存备用。

1.3.2 热预处理及酶解试验 取适量脱钙鱼鳞粉，加纯水至料液比为2%，121℃热处理15 min后进行酶解。酶解工艺流程为:质量分数2%的罗非鱼鱼鳞溶液→121℃预热处理15 min→酶解→沸水浴灭酶10 min→10 000 r·min-1离心20 min→上清液即为罗非鱼鱼鳞酶解液。

1.3.2.1 蛋白酶种类的筛选 以碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶和风味蛋白酶为筛选对象，控制加酶量(E/S)0.1%、酶解时间2 h、酶解温度和pH值为各蛋白酶的最适值(表1)的条件下进行酶解反应。以酶解产物水解度和ACE抑制率为指标筛选出最适蛋白酶。

表1 蛋白酶最适酶解条件Table1 Optimal enzymatic conditions for proteases

1.3.2.2 单因素试验设计

1)酶解时间对罗非鱼鱼鳞酶解效果的影响:在酶解温度50℃、pH值8.0、酶底比(E/S)0.1%条件下，设定不同的酶解时间:30、60、90、120、150、180、240 min。

2)酶底比(E/S)对罗非鱼鱼鳞酶解效果的影响:在酶解温度50℃、pH值8.0、酶解时间2 h条件下，设定不同的酶底比:0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%。

3)酶解pH值对罗非鱼鱼鳞酶解效果的影响:在酶解温度50℃、酶底比1%、酶解时间2 h条件下，设定不同的 pH 值:7.5、8.0、8.5、9.0、9.5。

4)酶解温度对罗非鱼鱼鳞酶解效果的影响:在pH值8.0、酶底比1%、酶解时间2 h条件下，设定不同的酶解温度:45、50、55、60、65℃。

1.3.3 鱼鳞原料基本成分的测定 参照GB/T 5009.5-2016[14]的方法测定鱼鳞原料的蛋白质含量。

1.3.4 罗非鱼鱼鳞酶解产物水解度的测定 采用OPA法，根据Spellman等[15]的方法并略作修改。配制OPA试剂(现用现配):将7.620 g四硼酸钠和200 mg SDS用150 mL去离子水溶解，待完全溶解后加入4 mL溶有160 mg OPA的乙醇溶液，混匀后再加入176 mg二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol，DTT)，定容至 200 mL。

水解度的测定:取400 μL样品(罗非鱼鱼鳞酶解液稀释20倍所得)，加入到装有3 mL OPA的试管中，混匀后静置2 min，测定其在340 nm波长处的吸光度值。以纯水作为空白组，100 mg·L-1丝氨酸溶液代替样品作标准曲线，根据标准曲线计算鱼鳞酶解液中游离氨基含量，并按照公式计算水解度(hydroloysis degree，HD):

1.3.5 罗非鱼鱼鳞酶解产物ACE抑制率的测定 参照Wu等[16]的方法并略作修改。用0.1 moL·L-1硼酸缓冲液(pH值8.3，含有0.3 moL·L-1NaCI)配制反应底物 N-马脲酰组氨酰亮氨酸(N-hippuryl-histidylleucine，HHL，6.5 mmoL·L-1)和 ACE(100 U·L-1)。 取适量鱼鳞酶解液稀释至40 μL，与25 μL ACE溶液混合并于振荡器中混匀，37℃水浴保温10 min，然后加入40 μL HHL溶液启动反应，37℃水浴继续保温30 min，最后加入85 μL 1 moL·L-1HCl溶液终止反应。反应溶液经0.45 μm滤膜过滤后，用于HPLC分析测定反应中产生的HA的量。

色谱条件:采用Waters2695 HPLC系统和UV/Vis检测器，SunFire C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。上样量10 μL，检测波长228 nm，流动相为乙腈—0.1%TFA水溶液 (30∶70，v/v)，流速为 0.8 mL·min-1。按照公式计算ACE抑制率:

式中，A为用纯水代替酶解物参与反应条件下所产生的HA的量；B为酶解物参与反应的条件下所产生的HA的量。

1.3.6 响应面试验设计 在单因素试验的基础上，采用碱性蛋白酶对样品进行酶解一定时间(2 h)，选取酶解温度(A)、pH值(B)和酶底比(C)3个考察因素为自变量，ACE抑制率(%)为响应值，采用三因素三水平的响应面分析法进行试验设计，研究各考察因素对罗非鱼鱼鳞酶解效果的影响。响应面试验设计与因素水平编码表见表2。

表2 响应面法的因素水平编码Table2 Factor and level of the response surface method

1.3.7 罗非鱼鱼鳞酶解产物相对分子质量分布测定 参照黄丹丹等[17]的方法并略作修改。取适量鱼鳞酶解液，经0.45 μm滤膜过滤后上样分析。色谱条件为:采用 Waters2695 HPLC系统和 UV/Vis检测器，TSKgel G2000-SWxl(7.8 mm ×300 mm，Tosoh)色谱柱，检测波长220 nm，洗脱液为45%乙腈-55%水溶液(0.1%TFA)，流速 0.5 mL·min-1，进样量 10 μL。 相对分子质量校正曲线所用标准品分别为:HHL(429 Da)、杆菌肽(1 422 Da)、抑肽酶(6.5 kDa)、细胞色素C(12.4 kDa)、碳酸酐酶(29 kDa)。

1.4 数据处理

试验数据以平均数±标准差(Mean±SD)表示。采用SPSS 17.0统计软件进行方差分析(ANOVA)，用Duncan多重比较法进行显著性检验(P＜0.05)；应用Origin7.5进行数据整理、作图，并用 Design Expert 8软件对响应面试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 罗非鱼鱼鳞酶解蛋白酶的筛选

图1 不同蛋白酶种类对鱼鳞酶解产物水解度和ACE抑制率的影响Fig.1 Effect of different protease on the hydrolysis degree and ACE inhibition rate of fish scale hydrolysates

由图1可知，不同种类的蛋白酶对罗非鱼鱼鳞蛋白的酶解效果差异较大，且ACE抑制率大小与水解度高低呈正相关，二者由大到小的顺序均为:碱性蛋白酶＞胰蛋白酶＞中性蛋白酶＞复合蛋白酶＞风味蛋白酶，这可能是因为不同种类的蛋白酶能够作用的特定的酶切位点不同，导致酶解产物水解度不同，产生ACE抑制肽的量也不同。碱性蛋白酶的酶解效果较好，故选用碱性蛋白酶作为酶制剂进行后续罗非鱼鱼鳞酶解条件的优化。

2.2 单因素试验结果分析

由图2-A可知，随着酶解时间的延长，罗非鱼酶解产物水解度呈不断上升趋势；ACE抑制率在前120 min内呈增大趋势，酶解 120 min时达到最大值(77.79%)，继续延长酶解时间，鱼鳞酶解液的ACE抑制率开始下降。Bougatef等[18]和Wu等[19]研究发现ACE抑制率随水解度增大呈先升高后降低趋势，这可能是因为酶解时间越长，水解度越大，同时释放出更多的ACE抑制肽；但酶解时间过长，一些已经形成的ACE抑制肽会在蛋白酶的作用下被进一步水解为无活性的分子[20]，使得ACE抑制率降低。因此，选用120 min作为罗非鱼鱼鳞的最佳酶解时间。

由图2-B可知，随着酶底比的增大，罗非鱼酶解产物的水解度呈上升趋势；当酶底比为0.1%～1.0%时，鱼鳞酶解产物的ACE抑制率随酶底比增大而升高，酶底比为1.0%时达到最大值(86.09%)，继续增大酶底比，鱼鳞酶解产物的ACE抑制率无明显变化。因此，选取1.0%作为罗非鱼鱼鳞酶解的最佳酶底比。

由图2-C可知，随着pH值的增大，鱼鳞酶解产物水解度和ACE抑制率均呈先升高后下降的趋势。其中，当pH值为7.5～8.0时，鱼鳞酶解产物水解度显著升高(P＜0.05)，pH值为8.0～8.5变化不明显，继续增大pH值，水解度明显开始下降(P＜0.05)；pH值为7.5～8.0时，鱼鳞酶解产物ACE抑制率显著升高(P＜0.05)，pH值大于8.0时，ACE抑制率明显下降(P＜0.05)。在不同pH值条件下，蛋白质的解离状态不同，蛋白底物与蛋白酶的接触位点也不同，因而导致酶解产物不同[21]。综上，pH值为8.0时，碱性蛋白酶酶解鱼鳞制备ACE抑制肽的酶解效率最高，故选用8.0作为鱼鳞酶解的最佳pH值。

由图2-D可知，随着酶解温度的升高，罗非鱼鱼鳞酶解产物水解度和ACE抑制率均呈先上升后下降的趋势，且都在酶解温度为55℃时达到最大值，此时鱼鳞酶解产物水解度为14.11%，ACE抑制率为86.09%。综上，选用55℃作为鱼鳞酶解的最适酶解温度。

图2 单因素条件对鱼鳞酶解产物水解度和ACE抑制率的影响Fig.2 Effect of single factors on the hydrolysis degree and ACE inhibition rate of fish scale hydrolysates

2.3 响应面试验结果分析

2.3.1 二次响应面回归模型的建立与分析 采用Design-Export 8.0.6软件，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理进行响应面设计。在单因素试验的基础上，选取酶解温度(A)、pH值(B)和酶底比(C)3个因素为自变量，以酶解产物ACE抑制率(Y)为目标函数，作三因素三水平共15个试验点，包括5个中心点和10个析因点。响应面试验设计及结果见表3。

对表3进行回归分析得到相应的二次响应面回归方程:

Y=87.54＋2.39A＋1.81B＋0.64C-7.18AB＋5.56AC＋3.90BC-6.05A2-8.85B2-5.79C2。

由表4可知，回归模型P＜0.000 1，极显著(P＜0.01)；模型的一次项A，二次项A2、B2、C2及交互项AB、AC、BC，对鱼鳞酶解产物ACE抑制率的影响极显著(P＜0.01)，一次项B对鱼鳞酶解产物ACE抑制率的影响显著(P＜0.05)，说明各因素对鱼鳞酶解产物ACE抑制率的影响不是简单的线性关系，存在一定的交互作用。失拟项P=0.418 7，不显著，表明失拟误差相对于纯误差是不显著的，模型拟合程度良好；F值可评价各因素其对试验指标的影响程度，根据F值得出各因素对鱼鳞酶解产物ACE抑制率的影响顺序为A＞B＞C。相关系数R2=99.84%，说明响应值的变化有99.84%与所选变量有关。模型的校正系数R2Adj=99.56%，说明不确定因素对试验结果的干扰较小，该模型与数据拟合度较好，比较可靠[22～24]，可以用此模型分析和预测鱼鳞蛋白酶解制备ACE抑制肽的情况。

表3 响应面试验设计及结果Table3 Design and results of the response surface experiments

表4 回归模型方差分析结果Table4 Variance analysis results of regression model

2.3.2 各因素交互作用对罗非鱼鱼鳞酶解效果的影响 由图3可知，酶解温度(A)的响应面曲线坡度较大，表明其对鱼鳞蛋白酶解物ACE抑制率的影响最为显著；pH值(B)次之，而酶底比(C)的响应面曲线较平滑，说明酶底比对ACE抑制率的影响相对较小，这与回归模型方差分析中的一次项显著性结果一致。

图3 各因素交互作用对鱼鳞酶解物ACE抑制率的影响Fig.3 Effect of interaction of various factors on ACE inhibition rate of fish scale hydrolysates

2.3.3 验证试验 采用Design-Export 8.0.6软件，以最高ACE抑制率为目标进行分析，得到碱性蛋白酶酶解鱼鳞制备ACE抑制肽的最佳酶解条件为:酶解温度56.33℃，pH值8.02，酶底比1.1%，此条件下鱼鳞酶解产物ACE抑制率理论值为87.95%。为验证响应面模型的有效性，根据优化结果进行3次平行试验，实际验证试验条件为:2%的鱼鳞原料采用碱性蛋白酶酶解2 h，酶解温度56.3℃，pH 值8.0，酶底比1.1%，测得酶解产物ACE抑制率实际值为88.26%，与理论值接近，且重复性较好，说明响应面优化结果可靠。

2.4 罗非鱼鱼鳞酶解产物相对分子质量分布情况

以各标准品保留时间(t)为横坐标，分子质量的对数[lg(M)]为纵坐标作标准曲线(图4)。由标准曲线可知，分子质量的对数[lg(M)]与保留时间(t)呈良好的线性关系，回归方程为:lg(M)=-0.219t＋7.192，决定系数R2=0.996。根据回归方程计算出样品相对分子质量在各范围的分布情况。

图4 相对分子质量标准曲线Fig.4 Standard curve of relative molecular mass

由图5可知，罗非鱼鱼鳞经最优酶解条件下酶解制得的酶解产物，相对分子质量分布整体较小，主要集中在300～3 000 Da之间，不存在3 000 Da以上分子，其中相对分子质量为2 568、1 396、731、302 Da的肽段分别占11.92%、21.61%、34.48%和28.57%，还存在3.43%相对分子质量在300 Da以下的小分子。说明在优化后的酶解条件下，罗非鱼鱼鳞蛋白酶解比较彻底，酶解效果较好。

图5 鱼鳞酶解产物相对分子质量分布色谱图Fig.5 Chromatogram of relative molecular mass distribution of fish scale hydrolysate

3 讨论

酶解法反应条件温和，绿色高效，能很好地保存氨基酸的营养价值，且无毒无害，安全性极高，是当前制备降血压活性肽的主要手段之一。曾健辉等[11]运用响应面法优化了碱性蛋白酶酶解鱼鳞直接制备ACE抑制肽的工艺条件，其最优条件为加酶量6.1%、pH值8.9、酶解温度54.7℃、酶解时间2 h。研究表明，85℃/1.5 h热处理结合粉碎处理能显著提高鱼鳞胶原蛋白肽的产率及产物特性[25]，但有关鱼鳞在更高温度下的酶解过程鲜有报道。通过适度的高温处理破坏蛋白质分子的高级结构，使其刚性结构柔性化[26]，从而形成利于提取或酶解的解离状态，是蛋白质物理改性研究中的热点。如Yang等[27-28]研究了高温条件下制备罗非鱼皮明胶水解液；Min等[29]研究发现水热处理(150～250℃)可用于生产猪皮副产物蛋白质水解物；王彦蓉等[30]研究了高温处理下罗非鱼皮鱼鳞混合物的酶解特性；沙小梅等[31]采用高温水对鱼骨进行软化处理。本研究采用121℃热预处理鱼鳞蛋白，一方面利于鱼鳞内部的胶原蛋白从表层羟基磷灰石等抗性屏障中溶出，另一方面适度热处理可使蛋白质分子间的疏水键、氢键和某些共价键断裂，使其蛋白结构，尤其是致密的胶原三螺旋结构变得松散，从而暴露出更多的酶切位点，提高酶解效率，但对高温处理过程中鱼鳞胶原蛋白构效关系还有待进一步研究。高温处理会改变鱼鳞蛋白的结构进而影响其酶解进程，因而也就可能会改变蛋白酶酶解的最优条件，为了获得更多鱼鳞酶解液ACE抑制肽，有必要对其酶解条件进行优化。

贺江等[32]采用酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶3种蛋白酶酶解草鱼鱼鳞胶原蛋白制备ACE抑制肽，发现酸性蛋白酶酶解效果最佳，这与本研究结果不同。本试验通过比较5种不同的蛋白酶对鱼鳞的酶解效果，确认最佳蛋白酶为碱性蛋白酶，这可能是因为不同的蛋白酶只能作用于特定的酶切位点，而本试验采用的罗非鱼鳞与贺江等[32]使用的草鱼鳞具有不同的氨基酸组成与氨基酸序列，因此具有最佳酶解效果的蛋白酶不同。除原料和蛋白酶种类外，鱼鳞蛋白的酶解效果也与酶解温度、pH值、酶添加量及酶解时间等工艺参数有关。张丰香等[33]采用中性蛋白酶酶解草鱼鱼鳞制备ACE抑制肽，优化得到最佳工艺条件为:pH值6.4、酶解温度50℃、加酶量([E]/[S])5%、水解时间3 h；吴靖娜等[13]研究复合蛋白酶酶解罗非鱼鱼鳞胶制备ACE抑制肽，得到最佳工艺条件为:pH值7.5、酶解温度50℃、加酶量([E]/[S])1.5%、水解时间6 h。本研究结果表明，碱性蛋白酶酶解鱼鳞蛋白制备ACE抑制肽效果最佳，通过单因素及响应面试验优化最佳酶解条件为:酶解时间 2 h、酶解温度56.3℃、pH值8.0、酶底比1.1%，该工艺参数与前人研究结果相比，酶的添加量更少，酶解效率更高，这主要是因为预先对鱼鳞采用了高温热预处理，使鱼鳞部分蛋白质溶出，蛋白质结构变得松散，更易于被酶切，因此，在酶解时只需要较短的时间和较少的蛋白酶添加量就能达到较好的酶解效果。ACE抑制肽一般具有较小的相对分子质量，本试验所制得的罗非鱼鱼鳞酶解产物相对分子质量分布集中在300～3 000 Da，普遍较小，表明制得的酶解产物中ACE抑制肽含量较高。

4 结论

本研究通过响应面法对酶法制备罗非鱼鱼鳞蛋白降血压活性肽的工艺进行优化，得到的最佳蛋白酶种类为碱性蛋白酶，最优酶解工艺条件为:酶解时间2 h、酶解温度56.3℃、pH值8.0、酶底比1.1%，此条件下罗非鱼鱼鳞酶解产物ACE抑制率为88.26%，酶解产物相对分子质量集中在300～3 000 Da之间。本试验结果可为鱼鳞蛋白降血压活性肽的实际生产提供一定理论依据，但本研究只对鱼鳞蛋白降血压肽的制备工艺进行了初步研究，制备的ACE抑制肽也为粗提物，故今后可对ACE抑制肽粗提物做进一步分离纯化，以制备更高纯度的降血压活性肽。