菜用豌豆品种资源萌发期耐旱性鉴定

赵愉风 周清元 郜欢欢 叶 桑 王 倩 程 闯 郭彦军 崔 翠

(西南大学农学与生物科技学院，重庆 400715)

豌豆(Pisum sativum)为豆科(Leguminosae)豌豆属(Pisum)一年生藤本作物，是世界上第四大食用豆类作物[1]。我国干豌豆栽培面积和总产量分别占全世界的 15.2%和 13.8%，青豌豆分别占全世界的23.1%和30.4%，在世界豌豆生产中占有十分重要的地位[2]。史料记载豌豆起源于西亚和地中海沿岸，我国豌豆的栽培历史可追溯到2000多年前[3]。豌豆各部位包括豌豆苗、豌豆尖、豌豆荚、青豌豆、干豌豆，从发芽到生长，从开花到成熟，均可食用，且豌豆营养价值丰富、用途广泛、适应性强，可用作主要旱区轮作倒茬作物；此外，豌豆种植过程中能进行生物固氮，提高土壤肥力，也是良好的绿肥作物[4]。然而豌豆生长过程中易受到干旱胁迫的影响，表现为植株高度降低，鲜重、干重、叶面积、叶片数下降，根系生长受到抑制等[4-5]。我国52.5%的豌豆生产区为山区或干旱、半干旱地区[6]，水资源短缺严重影响了豌豆的产量和品质[7]。因此筛选适宜的抗(耐)旱豌豆种质资源对豌豆栽培生产具有重要意义。

种子萌发是作物生活史的重要部分，该阶段与幼苗成活率、营养器官生长及籽实产量密切相关[8]。种子萌发始于静止的干燥种子吸收水分，待胚根突破种皮，种子即萌发完成[9]。种子发芽受到水分、温度、光照等环境因素影响[10]，若豌豆种子萌发过程中出现水资源短缺会导致萌发时间延长，出苗率降低，使幼苗瘦弱，生长后期严重缺水甚至会导致幼苗体内物质代谢紊乱，生长缓慢甚至死亡，严重影响豌豆苗、豌豆尖、豌豆荚及青豌豆的产量和品质[10]。前人研究主要集中在干旱胁迫对豌豆的农艺性状指标和生理生态响应方面[9-13]，对豌豆种子萌发期耐干旱种质资源的筛选报道并不常见。

本试验对不同主产区收集到的菜用豌豆品种资源进行种子萌发期的耐旱性研究，利用PEG-6000模拟干旱环境，调查种子在萌发期部分性状并根据综合抗旱系数值(CDC值)、耐旱性度量值(D值)、加权关联度(WDC值)大小对供试种质进行排序，通过相关性分析、主成分分析、聚类分析、灰色关联度分析和逐步回归分析等方法相结合对其耐旱能力进行综合评价，研究豌豆种质在萌发过程中的室内耐旱性鉴定方法和主要参考指标，以期筛选出耐旱性强的品种(系)，为耐旱性品种(系)选育和生产中品种优化布局提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

选择不同豌豆生产区域主要种植的31份豌豆品种(系)为试验材料(表1)，由西南大学农学与生物科技学院提供，于2017年3-5月进行发芽试验。

表1 参试品种(系)Table1 Tested varieties(line)

1.2 适宜PEG浓度的筛选及试验设计

选取遗传背景不同的3份豌豆种子材料16158、16141、16106，分别用 0(CK)、1.0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%6个不同梯度浓度(w/w)的PEG-6000溶液进行处理。每品种选取360粒大小一致的种子，分别用75%乙醇溶液消毒1～2 min，清水冲洗干净后，将种子置于培养皿中(每皿20粒)，并加入适量清水置于25℃RXZ智能型人工气候箱(宁波江南仪器厂)进行24 h吸胀作用，取出后将种子重新摆放在铺有双层滤纸并分别加入20 mL不同浓度PEG-6000溶液的培养皿中进行干旱胁迫处理，每处理设3次重复，对照组则加蒸馏水代替PEG溶液。培养皿放在光照培养箱中进行发芽试验，温度为25℃，光周期为光照16 h/黑暗8 h，3 d后统计发芽势，7 d后统计发芽率，根据种子萌发比例及萌发后生长情况筛选适宜的干旱胁迫处理浓度。

1.3 模拟干旱胁迫处理及其性状调查分析

选用31份豌豆种质(表1)，按照浓度筛选时的方法和培养条件，以1.2中筛选得到的PEG-6000浓度作为胁迫浓度，每处理设3次重复。处理60 h后计算种子吸水率(seed water absorption ratio，WAR)；每天调查种子发芽数、3 d后统计发芽势，7 d后统计发芽率，并每皿选取10颗籽粒测量其鲜重(fresh weight)、干重(dry weight)、根长(root length，RL)、芽长(buds length，BL)等性状，计算发芽势(germination energy，GE)、发芽率(germination rate，GR)、发芽指数(germination index，GI)、根冠比(root/shoot ratio，RSR)、活力指数(vitality index，Ⅵ)及物质贮藏转运率(storage material transfer rate，STR)等指标。计算方法如下:

式中，Gt为第t天的发芽数，Dt为相应时间的发芽天数。

1.4 评价方法及数据统计分析

参考闫峰等[14]、罗俊杰等[15-16]、王兰芬等[17]、汪灿等[18-20]的方法，以豌豆各品种10个指标的测量值作为基础数据，对各性状测量值求平均后进行差异显著性分析，按照公式(7)、(8)分别计算单项耐旱系数(drought tolerance coefficient，DC)和综合抗旱系数(comprehensive drought tolerance coefficient，CDC):

式中，Xij、CKij分别代表第i个指标第j个品种的干旱胁迫处理和CK测定值。

按公式(9)、(10)分别计算因子权重系数(ωi)和各指标的隶属函数值[u(Xij)]:

式中，Pi代表第i个指标的综合贡献率；Xijmin、Xijmax分别代表第i个指标下第j个品种的DC值的最小值和最大值。

按公式(11)计算耐旱性度量值(drought tolerance evaluation value，D):

式中，U(Xi)为各主成分得分值；k为主成分分析中综合因子个数。

按公式(12)、(13)计算关联系数(ξi)和等权关联度(γi):

式中，Δij代表品种最优性状与第i个指标第j个品种(系)的的绝对差值；minΔij和maxΔij分别代表最小二级绝对差值和最大二级绝对差值；p为分辨系数(p=0.5)。

按公式(14)、(15)分别计算各指标权重系数[ωi(γ)]和加权关联度(weight drought tolerance coefficient，WDC):

以DC值为比较序列，分别以D值和WDC值为参考序列进行灰色关联度分析，获得各指标DC值与D值之间的关联度(γD)及DC值与WDC值之间的关联度(γWDC)。

根据供试豌豆各品种(系)的D值，以加权配对算术平均法和欧氏距离进行聚类分析，并划分出各品种的耐旱等级，分别对D值、CDC值和WDC值逐步回归分析各指标DC值，获得回归方程。采用 Microsoft Excel 2010、IBM SPSS 19.0和SPSS 24.0统计软件对数据进行整理和分析。

2 结果与分析

2.1 PEG-6000适宜浓度的筛选

由表2可知，3份豌豆品种(系)在不同PEG-6000浓度处理条件下，根长均受到不同程度的抑制。在0(CK)、1.0%、2.5%、5.0%、7.5%和 10.0%浓度下，3份豌豆品种(系)根长均值分别为4.38、3.63、2.92、2.52、2.00、1.74 cm，各处理组根长较 CK 分别下降 了 17.12%、33.33%、42.47%、54.33% 和60.27%。根长在2.5%PEG-6000处理下，与CK差异显著，在1.0%～2.5%PEG间豌豆根长下降幅度最大。同时随着PEG-6000浓度的增加，在5.0%时，16106根长受到严重抑制。综上，将2.5%PEG-6000作为菜用豌豆耐旱品种资源筛选的浓度。

表2 不同浓度的PEG-6000胁迫处理对豌豆萌发期根长的影响Table2 Effects of different concentrations of PEG-6000 stress on root length during pea germination stage /cm

2.2 豌豆萌发期指标分析

由表3可知，CK和PEG-6000处理31个品种间差异均达到极显著水平；各性状变异系数分别介于19.30%～95.27%和20.34%～99.63%，其中芽长变异系数最大(95.27%和99.63%)，总鲜重变异系数最小(19.30%和20.34%)，按变异系数从大到小排序，CK豌豆各性状依次为芽长＞活力指数＞物质储藏转运率＞根冠比＞根长＞发芽势＞发芽指数＞发芽率＞种子吸水率＞总鲜重，PEG处理各性状依次为芽长＞根冠比＞活力指数＞物质储藏转运率＞根长＞发芽势＞发芽指数＞发芽率＞种子吸水率＞总鲜重。综上表明，31份豌豆材料在种子萌发过程中各相关性状均存在者广泛的遗传基础，在其中进行耐旱性筛选是有效的。

表3 豌豆种子萌发相关指标分析Table3 Analysis on indexes related to pea seed germination

2.3 单项指标分析

分别对各性状的耐旱系数(DC)进行分析(表4)，结果显示，各性状指标的DC值变异系数介于5.62%～78.60%之间，其中芽长的变异系数最大，达到78.60%，种子吸水率和总鲜重变异系数较小，分别为5.62%和7.60%，说明PEG-6000胁迫处理后芽长受到的影响较大，而种子吸水率和贮藏物质转运率变化较小；从各性状DC值变异系数来看，芽长(78.60%)、根冠比(76.16%)、活力指数(61.15%)、贮藏物质转运率(52.33%)和根长(40.02%)在品种间变异幅度较大，可以作为种子萌发期耐旱资源筛选指标。从芽长DC值来看，大于平均值的品种(系)有15个，其中16104、16078、16107、16110、16139 和 16040 6 个品种(系)的DC值均大于1，说明模拟干旱胁迫条件下，这些种质芽长并没有受到影响，反而具有一定的促进作用；31份豌豆根冠比 DC值平均值为 1.55，其中16147、16023、16140、16055、16105 的 DC 值较大，均大于3.0；活力指数DC值总体均值为0.77，大于均值的豌豆种质有14份，按照其大小排名前5的分别为16110、16107、16079、16040 和 16078；按贮藏物质转运率DC值大小排序，排名靠前的品种主要为16110、16107、16141和16040；按根长DC 值进行排序，16110、16141、16107、16146、16040 和 16170 排名靠前。 从各单项指标来看，不同材料在不同的单项指标中表现不同，通过单项指标对31份种质进行耐旱性筛选结果也不相同，因此仅通过单项指标对豌豆种质萌发期耐旱性筛选存在着局限性。

表4 豌豆种质各指标的耐旱系数(DC)Table4 Drought-tolerance coefficients of parameter during seeds germination for pea germplasms

由表5可知，豌豆各指标(除根冠比)都与其他至少一个指标呈显著或极显著相关，表明各指标之间具有一定程度的相关性。其中发芽势与发芽率、发芽指数、活力指数、根长、芽长、物质贮藏转运率呈极显著正相关，相关系数介于0.554～0.921之间，相关程度较高；物质贮藏转运率与总鲜重呈显著相关，相关系数为0.387；总鲜重与活力指数、种子吸水率呈极显著正相关，相关系数分别为0.570、0.579；种子吸水率与活力指数呈显著正相关，相关系数是0.385，说明种子活力越强，其吸水保水能力越好，可进一步使鲜重增加。根冠比是由根长和芽长2个单一性状组成的复合性状，结果显示根冠比与2个单一性状之间并没有显著相关性，说明不同材料在受到胁迫时没有表现出相同的变化趋势。以上结果表明，干旱胁迫影响根的生长发育，从而影响豌豆种子发芽(发芽势、发芽率、发芽指数)、活力指数、地上部生长(芽长)和物质贮藏转运。

表5 豌豆种质各指标耐旱系数(DC)的相关性Table5 Correlations of drought-tolerance coefficients between parameters during germination of pea germplasms

参照连续变数的次数分布统计方法[21]，以组距为0.2将各性状耐旱系数作次数分布表(表6)。结果表明同一区间内的各指标DC值分布次数和频率相差较大。0.6＜DC≤1.2范围内，各指标分布较集中，发芽指数、活力指数、发芽势、发芽率、根长、贮藏物质转运率、总鲜重、根冠比、种子吸水率和芽长的分布频率分别为 74%、61%、74%、74%、68%、54%、100%、35%、100%、39%；1.2＜DC≤2.0时，发芽指数、活力指数、发芽势、发芽率、根长、贮藏物质转运率、根冠比、芽长的分布频率分别为 9%、3%、9%、9%、12%、6%、24%、9%，说明这些指标对干旱胁迫的反应灵敏；DC＞2.0时根冠比的分布频率为26%，表明干旱胁迫对多数品种的根冠比影响较大。各指标对干旱胁迫反应的敏感性从小到大依次为芽长、贮藏物质转运率、活力指数、种子吸水率、根长、发芽率、发芽势和发芽指数、根冠比、总鲜重。不同性状对干旱胁迫的响应程度存在差异，同一品种(系)不同指标间耐旱系数也不完全一致。次数分布和单一指标(DC值分析)均表明，豌豆耐旱性种质资源筛选鉴定需要通过多个指标进行综合评价，才有可能避免片面性。

2.4 萌发期主成分分析

参照唐启义[22]数据处理系统进行主效因子分析，其中，因子个数的选取遵循两条原则:一是累积贡献率要占总贡献率的80%以上；二是特征值要大于等于1。由表7可知，各因子特征值中前3个因子的贡献率分别为52.423%、15.717%和13.344%，累计贡献率达81.483%，其特征根 λ＞1.334。其中，主成分1(F1)在发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数和物质贮藏转运率有较高载荷量，载荷量分别为0.888、0.896、0.913、0.948、0.888，这5个指标反映了豌豆种子萌发期的萌发状况。主成分2(F2)在根冠比和种子吸水率上载荷量较大，分别为0.656、0.641，这2个指标反映了豌豆的生长积累状况。主成分3(F3)在总鲜重上载荷量最大，为0.783，其反映了豌豆的生长状况。

2.5 菜用豌豆种质资源耐旱性综合评价

由表8可知，供试种质综合耐旱系数(CDC值)介于0.307～1.449之间，平均值为 0.909，标准差为0.248，变异系数为27.308%。根据CDC值大小对供试种质进行耐旱性排序，耐旱性最强的4个品种依次为16110、16055、16140、16107；耐旱性最弱的3 个品种依次为16106、16175、16177，其余种质介于两者之间。耐旱性度量值(D值)介于2.359～11.147之间，平均值为6.603，标准差为1.779，变异系数为29.346%。根据D值大小对供试种质进行耐旱性排序，耐旱性最强的4 个品种依次为16110、16107、16055、16140，耐旱性最弱的3个品种依次为16106、16175、16177。WDC值大小为 0.307～1.441，平均值为 0.915，标准差为0.250，变异系数27.342%。基于加权关联度(WDC值)大小进行耐旱性排序，结果显示，耐旱性最强的4个品种依次为16110、16055、16140和16107；耐旱性最弱的3个品种依次为16106、16175和16177。D值、CDC值、WDC值对供试品种耐旱性评价结果基本吻

合，将3种排序顺序相加，进行综合排序，耐旱性最强的4 个品种依次为16110、16055、16107、16140，耐旱性最弱的3个品种依次为16106、16175和16177。

表6 供试豌豆种质各指标耐旱系数的频次分布Table6 Different distributions of drought-tolerance coefficients of all indices in tested pea germplasms

表7 供试豌豆种质各指标主成分的特征向量及贡献率Table7 Eigenvectors and contribution rates of principal components of all indices in tested pea germplasms

表8 供试豌豆品种(系)耐旱性评价的DC值、WDC值、D值的综合排序Table8 Comprehensive ranking of DC value，WDC value and D value of drought tolerance evaluation in tested pea germplasms

2.6 灰色关联度分析

由表9可知，在干旱胁迫下，等权关联度(γD)反映各指标DC值与D值的密切程度，其值介于0.502 2～0.551 6之间，从大到小依次为根冠比、种子吸水率、总鲜重、发芽率、发芽指数、发芽势、根长、活力指数、物质贮藏转运率和芽长。灰色加权关联度(γWDC)反映各指标DC值与WDC值的密切程度，其值介于0.7324～0.937 5之间，从大到小依次为发芽指数、发芽率、发芽势、总鲜重、种子吸水率、根长、活力指数、贮藏物质转运率、芽长和根冠比。

表9 供试豌豆种质各指标DC值与D值和WDC值的关联度及各指标权重Table9 Correlation degree between DC value of all indices and D value together with WDC value and indices weight in tested pea germplasms

2.7 聚类分析及耐旱级别的划分

以加权配对算术平均法进行聚类分析，在欧氏距离D2=8.5处，可以将31份供试豌豆品种(系)分为4类群(图1)。第Ⅰ类群包含16054、16142等 20份材料，占总数64.52%；第Ⅱ类群为包含16140、16079和16055共3份材料，占总数的9.68%；第Ⅲ类群包含16175、16177、16106、16096、16051 和 16104 共 6 份材料，占总数的19.35%；第Ⅳ类包含16110和16107共2份材料。统计4个类群各耐性评价单项指标、D值、CDC值和WDC值(表10)，结果表明，第Ⅰ类材料除芽长外其他各指标数据在4个类群中最低，说明第Ⅰ类群萌发期对干旱胁迫极敏感；第Ⅱ类群的D值、CDC值、WDC值高于第Ⅲ类群和第Ⅰ类群，可以归类为较耐旱材料；第Ⅳ类群2份材料除根冠比外其余9个单项指标和3个综合指标均最大，因此可以将该类群归类为耐旱性强材料。综上，4个类群耐旱性从强到弱依次为第Ⅳ类群＞第Ⅱ类群＞第Ⅲ类群＞第Ⅰ类群。

2.8 逐步回归分析

图1 基于D值的供试豌豆种质资源(抗)耐旱性聚类图Fig.1 Cluster map of drought tolerance of pea germplasm based on D value

表11 供试豌豆种质抗旱性模型预测Table11 Prediction of drought resistance model for tested pea germplasms

表10 供试豌豆种质抗性评价指标的分级Table10 Grading evaluation of index about drought resistance of pea germplasm

分别以D值、CDC值和WDC值为参考序列，对供试豌豆品种(系)各指标DC值进行逐步回归分析，得出3个逐步回归方程(表11)，通过F检验3个方程都达到极显著水平，说明3个方程拟合度好，预测精度较高，可用这3个方程进行菜用豌豆品种萌发期抗(耐)旱性评价。此外，由逐步回归方程可知，在豌豆种质资源萌发期抗(耐)旱性鉴定中，选择性地将与D值密切相关的指标，如发芽指数、活力指数、发芽势、根长进行测定，可有效鉴定豌豆种质资源的耐旱性，从而使鉴定工作简化，提高工作效率。

3 讨论

农作物抗逆性鉴定按照生育时期可分为萌发期鉴定、苗期鉴定和成株期鉴定[23]。萌发期是作物群体数量建成的关键时期，具有便于操作、周期短、效率高、易受环境影响等特点[24]。豌豆在种子播种后，干旱胁迫会导致其出苗率降低、出苗时间延长、生长发育受阻[25]。

目前，诸多研究者针对作物萌发期进行了抗(耐)旱性鉴定的研究，不同研究所采用的筛选鉴定指标都有所不同，最终筛选出来的耐旱性指标也存在差异。如陈学珍等[26]对20个大豆品种芽期耐旱性研究发现，在发芽势和发芽率均高的情况下，二者可作为耐旱性鉴定的指标。刘学义等[27]在大豆成苗期根毛与耐旱性的关系研究中发现胚根的长短与耐旱性密切相关，耐旱品种的胚根比其他类型的品种长。王利彬等[28]在大豆种质资源芽期耐旱性鉴定中发现干旱胁迫下胚根和下胚轴的生长状况可作为评价大豆芽期耐旱性的生理指标。陈新等[29]研究表明，植物抗(耐)旱性与萌发期种子活力指数具有一定的相关性，萌发期种子活力指数可以作为抗(耐)旱性鉴定的重要指标。Bewley[30]研究认为贮藏物质转运率在一定程度上可能决定了幼苗生长状况。本试验最终筛选出发芽势、发芽率、活力指数、活力指数、根长作为豌豆萌发期的优先耐旱性评价指标。

植物的耐旱性受遗传因子和环境共同控制，采取单项指标进行耐旱性评价的有效性和准确性较低，因此，同时观测多个指标，进行综合分析后对试验材料进行耐旱性评价很有必要[31]。本研究通过主成分分析法、隶属函数法得到抗(耐)旱性度量值(D值)，其能够综合各指标间的相互关系且避免了单一指标存在的片面性，可较准确地评价豌豆的抗(耐)旱性[32]。灰色关联度分析作为衡量因素间关联程度的一种方法，显示了各指标的重要性[33]。本研究以各指标DC值为比较序列，D值和WDC值为参考序列，结果显示各指标分析在D值和WDC值间有较强的一致性，与朱宗河等[34]和谢小玉等[35]对油菜的研究结果一致。聚类分析是通过应用变量的数值特征变化从而对研究对象进行分类的统计方法，具有一定的可靠性[36]。本试验以D值、CDC值和WDC值为依据进行各种(系)分类，在综合耐旱评价的基础上，将31份豌豆种质材料分为4类，这与薏苡[18-20]、胡麻[37]、小麦[38]等作物的耐旱性鉴定结果一致。本研究结果为今后菜用豌豆萌发期抗旱性鉴定提供了理论依据，也为耐旱豌豆品种的选育、优化布局与推广应用提供了一定的理论参考。

4 结论

本研究结果表明，31份豌豆品种资源在未干旱处理下，种子萌发相关性状指标变异系数介于19.30%～95.27%；而在模拟干旱处理下各指标变异系数介于20.34%～99.63%之间。各性状在品种间均存在着显著差异，表明31份豌豆材料具有广泛的遗传基础。通过单项指标DC值分析，每个单项指标筛选出耐旱性种质不同，表明单项指标筛选具有一定的局限性；根据综合抗旱系数值(CDC值)、耐旱性度量值(D值)、加权关联度(WDC值)大小对供试种质进行排序，其中耐旱最强的4个品种依次为16110、16055、16140和16107；耐旱性最弱的3个品种依次为16106、16175和16177。聚类分析将31份豌豆品种资源划分为4个类群。逐步回归分析表明，与D值密切相关的指标为发芽指数、活力指数、发芽势、根长，这些可作为豌豆种质资源萌发期耐旱性鉴定综合选择指标。本研究结果为菜用豌豆耐旱机理、干旱调控缓解机制、菜用豌豆耐旱品种培育及其推广等研究奠定了一定的理论。