藏药二十五味珍珠丸双通道特征图谱研究

王 红，韩晓萍

(1.青海省食品检验检测院，青海 西宁 810000；2.青海省药品检验检测院 青海 西宁 810000)

藏药经典方剂二十五味珍珠丸组方收载于藏医巨著《四部医典》，其处方由珍珠、西红花、牛黄、麝香等二十七味藏药组成。为更好地掌握本品种中牛黄、西红花两种药味的整体存在情况，本研究在现行质量标准及其余组分检测分析的文献研究[1-5 ]基础上，对处方中的牛黄、西红花进行了多组分多通道特征图谱研究，建立了二十五味珍珠丸的双通道(HPLC-TUV-ELSD)特征图谱。

1 材料与方法

1.1 材料

多通道串联高效液相色谱仪Waters 2695- 2489紫外检测器(TUV通道)-2424蒸发光散射检测器(ELSD通道)购自美国沃特世公司；百万分之一电子天平梅特勒XS105DU购自瑞士梅特勒公司；万分之一赛多利斯CPA 225D电子天平购自德国赛多利斯公司；必能信KQ5200超声波清洗器购自美国艾默生公司。

二十五味珍珠丸(编号A～E)，购自青海及西藏的2家生产企业及3家医院制剂室，共计5个品牌；原料药材购自青海金诃藏药股份有限公司。

胆酸(批号：110178-200814)、去氧胆酸(批号：110734-200907)、猪去氧胆酸(批号：100187-201410)、西红花苷-Ⅰ(批号：111588-201401)、西红花苷-Ⅱ(批号：111589-201402)、牛黄胆酸钠对照品(批号：110815-201406)购自中国食品药品检定研究院。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件选择

采用agilent 杜邦系列中的SB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)。流动相组成为乙腈A及1%甲酸B，按程序进行梯度洗脱，具体为0～60 min范围内流动相A自18%→40%，流速1 mL·min-1，柱温35 ℃，TUV检测波长440 nm。ELSD检测器参数设置：漂移管加热温度85 ℃，雾化气喷雾压力为32 psi，增益为95。理论塔板数按西红花苷-I色谱峰计，应高于8000[6-7]。

1.2.2 测试溶液制备

1.2.2.1 供试品溶液制备

取样品5粒，研细，称取2 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称重，超声处理40 min(功率250W，频率40kHz，加冰块)，取出，至室温时称定重量，用甲醇补重，滤过，取续滤液。

1.2.2.2 参照溶液制备

精密称取西红花苷-Ⅰ、Ⅱ对照品各10 mg，加甲醇制成每1 mL各约含 80 μg的混合溶液(TUV通道参照溶液)；另精密称取牛磺胆酸钠、胆酸、猪去氧胆酸及去氧胆酸四种对照品约25 mg，加甲醇制成每1 mL各约含0.1 mg的溶液(ELSD通道参照溶液)。其中分别以西红花苷-Ⅰ和胆酸作为各自通道的相应参照S峰[8]。

1.2.3 测定

分别精密吸取上述供试品溶液10 μL、两种西红花苷类混合对照品5 μL、四种胆酸类混合对照品10 μL，注入液相色谱仪分析测定，记录色谱图。

1.2.4 双通道特征图谱建立

通过与对照品及对照药材色谱的双重比对，对二十五味珍珠丸样品中的色谱峰进行归属和定位。建立的二十五味珍珠丸对照特征图谱见图1，图1显示，共有峰有15个，较为全面地反映了处方中两味药材信息。其中TUV440 nm通道主要考察方中西红花化学成分，ELSD通道考察方中牛黄化学成分[9]。

峰1(S)：西红花苷-Ⅰ；峰2：西红花苷-Ⅱ；峰8：牛黄胆酸钠；峰11(S)：胆酸；峰12：猪去氧胆酸；峰15：去氧胆酸

图1二十五味珍珠丸多通道特征图谱

Figure1Multi-channelcharacteristicsofchromatogramof25PearlPills

图1示，二十五味珍珠丸TUV色谱图中共确认出7个特征峰，峰1、2与西红花苷-Ⅰ、Ⅱ的保留时间相同，以峰1为S峰，计算其余6个峰与S峰的相对保留时间，分别为1.000(峰1)、1.318(峰2)、2.175(峰3)、2.388(峰4)、2.572(峰5)、2.960(峰6)、3.027(峰7)；ELSD色谱图中共确认出8个特征峰，其中峰8、11、12、15分别与牛磺胆酸钠、胆酸、猪去氧胆酸、去氧胆酸保留时间相同，以其中峰面积相对较高的峰10作为S峰，计算其余7个峰与S峰的相对保留时间，分别为0.585(峰8)、0.614(峰9)、0.726(峰10)、1.000(峰11)、1.081(峰12)、1.163(峰13)、1.208(峰14)、1.390(峰15)。其中峰1(S)为西红花苷-Ⅰ、峰2为西红花苷-Ⅱ、峰8为牛黄胆酸钠、峰11(S)为胆酸、峰12为猪去氧胆酸、峰15为去氧胆酸。

1.2.5 方法学考察

1.2.5.1 精密度考察

精密吸取1.2.2.1项下制备的二十五珍珠丸(20141120)供试品溶液10 μL，按1.2.1项下的色谱条件连续进样5次，分别测定TUV440 nm及ELSD通道下各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果均<3.0%，表明仪器精密度良好。

1.2.5.2 重复性试验

取二十五珍珠丸(20141120)同一样品6份，按照1.2.2.1项下供试品溶液的制备方法制备，在1.2.1项的色谱条件下分别测定其在440 nm及ELSD通道下的供试品溶液的特征图谱，计算上述各共有峰的相对保留时间、相对峰面积RSD，结果均<3.0%，说明本方法重复性较好。

1.2.5.3 稳定性试验

取二十五珍珠丸(20141120)样品，按1.2.2.1项下的要求制备成供试品溶液，分别于配制后的0、4、8、12、16、24 h进行进样分析测定，测定两品种在440 nm及ELSD通道下特征图谱中各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD，结果均<3.0%，说明按本法制备的供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2 结果及分析

按上述建立好的特征图谱测定的方法对收集的全部样品进行分析测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2010年版软件进行结果计算及评价，以考察两品种的工艺稳定性和样品均一性，结果分析如下：

2.1 同一生产企业不同批次二十五味珍珠丸多通道特征图谱比较结果及分析

对样品收集量大于三批次的企业产品见表3，进行特征图谱相似度分析，以各企业的平均特征图谱作为参照谱进行相似度对比分析(样本量大于3批次)，代表图谱见图2，相似度结果见表1。

图2同一生产企业二十五味珍珠丸多通道特征图谱比较图

Figure2Comparisonofcharacteristicsofchromatogramfromthesamemanufactory

表1同一生产企业特征图谱相似度比较结果

Table 1Comparison of similarity from the same manufactory

同一生产企业不同批次样品之间的相似度结果分析表明，企业批间产品的相似度总体较好，说明同一生产企业生产工艺和投料药材质量基本稳定。总体表现为两品种中TUV通道在整体企业间的相似度明显高于ELSD通道，说明各企业生产投料用的西红花药材的质量相对牛黄较稳定，特征图谱中共有峰的检出情况相对较好。

在TUV通道中，企业B的二十五味珍珠丸批间相似度仅为0.714，此结果与其测定的6批次样品中3批次的西红花苷-Ⅱ指标未检出有关，其余企业产品的批间相似度均大于0.90；在ELSD通道中，虽然企业B的二十五味珍珠丸批间相似度均大于0.90，但结合含量测定的数据，分析发现其两品种中均未检出相应检测指标，在与自身企业的样品平均图谱做对照的情况下，反而表现为图谱重复性较好，但实际为异常数据。其余企业产品批间相似度均在0.80～0.90之间。

2.2 不同生产企业二十五味珍珠丸多通道特征图谱比较结果及分析

经过对同处方量西红花、人工牛黄、培植牛黄、牛黄对照药材的图谱比对，筛选出相对质量较优、图谱特征丰富的样品作为对照特征图谱。

对全部企业样品进行比对分析的结果见表2。

表2不同生产企业产品相似度统计表

Table 2Statistics of similarity from different manufactory

与选定的平均对照图谱进行比对分析，结果表明，整体样品的TUV通道相似度范围为0.472～0.978，明显高于ELSD通道的相似度，说明相对于牛黄而言，各生产企业所用西红花质量稳定，投料规范。

结合牛黄中多指标成分的含量测定结果[3]分析发现，在二十五味珍珠丸中的ELSD通道中，除企业A外，其余企业样品中均未检出4种胆酸及其盐类，总体相似度偏低。企业A相似度相对较高，为0.621～0.959，企业D的样品中仅检出了牛黄胆酸钠和胆酸，相似度范围为0.321～0.543，E仅检出了胆酸，相似度为0.40左右。

综上所述，对二十五味珍珠丸中的西红花和牛黄质量均可通过本文所建立方法监测。

3 讨论

本研究在对二十五味珍珠丸进行文献研究及处方分析的基础上，对处方中药味西红花、牛黄中多个指标性成分进行了多通道特征图谱研究及含量测定，所得成果可以有效检测和评价该药物的整体质量。

本研究所获成果的特点是：①选取了药味西红花、牛黄中所含的西红花苷-Ⅰ、Ⅱ，牛磺胆酸钠，胆酸，猪去氧胆酸，去氧胆酸共计6个组分作为测定指标，实现了多通道多指标同时测定，能快速经济地对其进行较为整体的质量控制。②建立了能同时用于方中6个组分测定的HPLC-TUV-ELSD多通道含量测定方法。③建立了二十五味珍珠丸的HPLC-TUV-ELSD多通道特征图谱，能用于该品种的整体质量控制。