人巨细胞病毒IE1-72蛋白在胶质瘤中的表达及临床意义

丁大领 吴力新 张风江 郭宗泽 庞长河 刘献志 孙剑瑞*

(1郑州大学第一附属医院神经外科，河南 郑州 450052; 2中国医科大学附属第一医院神经外科，辽宁 沈阳110001)

脑胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，约占脑肿瘤的80%，具有侵袭性并且缺乏有效的治疗措施，而对于高级别脑胶质瘤患者的平均生存期一般只有12～15 个月，虽然手术及术后给于辅助治疗，但总体疗效仍很差[1-3]。人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)属于疱疹病毒 β 亚科，在人群中广泛传播， 病毒感染无季节性区别，全年皆可发生。我国是世界上 HCMV 感染率最高的国家之一，在普通人群中感染率80%以上，怀孕妇女原发或继发的 HCMV 感染可造成胎儿畸形、智力低下或发育迟缓等，严重者甚至可引起巨细胞包涵体病[4-5]。近年来，关于HCMV感染和脑胶质瘤的研究越来越多，并且存在较大的争议，本文通过分析人巨细胞病毒IE1-72蛋白在胶质瘤中的表达情况并且与患者预后的关系，为胶质瘤的发病机制提供理论依据。

材料与方法

一、一般资料

选择2007年1月至2016年12月郑州大学第一附属医院和中国医科大学附属第一医院神经外科接受手术治疗的脑胶质瘤组织标本89例，其中男55例，女34例，平均年龄(43.8±12.7)岁。对照组标本来自于原发性癫痫病灶切除术后脑组织。病理学诊断依据世界卫生组织(WHO)中枢神经系统肿瘤分级标准(2016年)[6]，WHO III级和Ⅳ级为高级别胶质瘤。所有患者均未接受过放、化疗及免疫治疗等相关治疗(表1)，所有患者通过电话询问或定期来院复查随访。随访8～36个月，中位随访时间为19个月。

二、免疫组织化学方法检测HCMV IE1-72蛋白的表达

选取典型的脑胶质瘤组织蜡块进行连续性切片，厚度4 μm，并放入68 ℃烤箱中烘烤20 min。石蜡经二甲苯脱蜡和不同浓度的乙醇水化后，3% H2O2室温孵育10 min，柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复2.5 min，阻断内源性过氧化物酶活性，并血清封闭。每张切片甩去多余血清后滴加50 μL已稀释鼠抗人IE1-72抗体 (Abcam, ab30924, 浓度为1 ∶40)，4 ℃孵育过夜。4 ℃过夜后需在37 ℃复温45 min，1×PBS洗3次。生物素标记二抗孵育和链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶孵育各20 min，DAB显色，显微镜下控制染色时间，苏木素核复染及返蓝，中性树胶封片，系统显微镜下分析照相。

三、结果判定

以细胞质或细胞核中出现棕黄色或者棕褐色颗粒为阳性，根据染色阳性细胞所占百分比和染色强度进行半定量分析。染色强度由两位研究员分别独立评分。每张切片选取5个不同的高倍视野进行观察，每个视野进行随机计数200个肿瘤细胞。染色强度评分(0分为无染色；1分为弱染色，浅黄色；2分为中度染色，黄褐色；3分为重度染色，棕黄色)和阳性细胞百分数评分(0分为阴性0%～1%；1分为阳性细胞数2%～25%；2分为阳性细胞数26%～50%；3分为阳性细胞数51%～75%；4分为阳性细胞数>75%)。染色指数=染色强度×染色阳性肿瘤细胞×比例。在染色指数评分大于4分，定义为高表达，染色指数评分小于4分，认为低表达。

四、统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析HCMV IE1-72蛋白表达水平与患者年龄、性别、病理级别的关系采用Spearman等级相关分析，HCMV IE1-72蛋白表达水平在胶质瘤与对照脑组织之间差异采用Wilcoxon秩和检验，构建Cox回归模型，分析HCMV IE1-72蛋白的表达水平与脑胶质瘤患者无进展生存期的关系。采用χ2检验计算各组之间的差异，以P<0.05认为有显著性差异，有统计学意义。

图1 HCMV IE1-72蛋白在脑胶质瘤和对照脑组织中的表达情况(免疫组化，×200)

Fig 1 HCMV IE1-72 protein expression in glioma and control brain tissues (IHC, ×200)

A: Astrocytoma (Grade II); B: Astrocytoma (Grade III); C: Glioblastoma tissues; D: Normal human brain tissues.

结 果

一、HCMV IE1-72蛋白在脑胶质瘤中表达

采用免疫组化方法检测89例脑胶质瘤组织中和10例对照脑组织标本中HCMV IE1-72蛋白的表达情况(图1A～D)，结果发现76.4%的(68/89)胶质瘤组织中出现HCMV IE1-72蛋白阳性反应，主要位于细胞核和(或)细胞质中，其中75.0%(24/32)Ⅱ级星形细胞瘤、70.9%(22/31)Ⅲ级星形细胞瘤和84.6%(22/26)胶质母细胞瘤中出现阳性表达，在肿瘤坏死组织及瘤周正常脑组织中无阳性表达，同时对照脑组织标本中也没有HCMV IE1-72蛋白表达(表1)，HCMV IE1-72蛋白在脑胶质瘤中的表达水平明显高于对照脑组织(Z=-4.915,P=0.000)。另外HCMV IE1-72蛋白免疫染色强度与脑胶质瘤患者的性别(r=0.059，P=0.586)、年龄(r=0.045，P=0.675)无明显的相关性。

二、HCMV IE1-72蛋白表达水平与脑胶质瘤病理级别的关系

在免疫组化半定量分析中，40.6%(13/32)的II级星形细胞瘤，51.6%(16/31)的III级星形细胞瘤和53.8%(14/26)的胶质母细胞瘤组织中出现HCMV IE1-72蛋白高度表达，高级别脑胶质瘤(Ⅲ～Ⅳ级)细胞核及细胞质中有较高的HCMV IE1-72蛋白表达，但我们发现HCMV IE1-72蛋白免疫染色强度与脑胶质瘤病理级别(r=0.112，P=0.295)无明显的相关性。同时，不同脑胶质瘤组织中HCMV阳性表达的肿瘤细胞数与染色强度具有较大差异，甚至在同一标本的不同染色部位结果也不相同。

表1 89名脑胶质瘤患者的临床特征和HCMV IE1-72蛋白的表达情况

Tab 1 Clinical features of 89 patients and the expressions of HCMV IE1-72 protein in glioma

Clinical featureCasesn% Total89 Sex Male5561.8 Female3438.2 Age (years) 10～403134.8 40～605056.2 ≥6089.0 Extent of resection Gross total removal6674.2 Residue<30%2325.8 IE1-72 Positive6876.4 Negative2123.6 Tumor grade Grade Ⅱ3235.9 Grade Ⅲ3134.8 Grade Ⅳ2629.3

三、HCMV IE1-72蛋白表达水平与脑胶质瘤患者的预后关系

虽然HCMV IE1-72蛋白在脑胶质瘤组织中不同程度的表达，但不同级别脑胶质瘤之间HCMV IE1-72蛋白表达量无显著性差异，同时我们决定评估在HCMV IE1-72蛋白阳性表达和无HCMV IE1-72蛋白表达的两组胶质瘤患者中其预后结果是否具有差异性。我们使用Kaplan-Meier生存分析方法，发现脑胶质瘤患者中IE1-72蛋白低表达组和高表达组患者的PFS无相关性(χ2=2.710，P>0.05)。见图2。

图2 脑胶质瘤组织中IE1-72蛋白低表达组和高表达组Kaplan-Meier生存曲线

Fig 2 Kaplan-Meier survival analysis chart of IE1-72 protein in glioma tissue of low expression group and high expression group

讨论

脑胶质细胞瘤是最普遍的恶性肿瘤之一，并且缺乏有效的治疗方法[2,6]，在我国其年发病率为5/10万，且发病率呈持续上升趋势。脑胶质瘤有高度浸润性生长的特点，术后发生复发转移的概率相当高并难以根治[7]。因此，怎样有效地抑制脑胶质瘤的复发已成为研究的热点。近年来研究显示，人巨细胞病毒(HCMV)感染与脑胶质瘤的关系存在较大的争论[8-13]。

HCMV属于双链线性结构的β亚科疱疹病毒，大小约为240 kb。HCMV在人群中广泛传播，感染无季节性区别。我国是世界上 HCMV感染率最高的国家之一，我国成人感染率接近100%。在人类个体不同发育时期，HCMV主要侵染的器官及细胞不同，在胎儿及新生儿时期，主要感染神经系统、肾脏上皮细胞；而在儿童时期，主要侵染淋巴组织。怀孕妇女原发或继发的 HCMV感染可造成胎儿畸形、智力低下等，严重者甚至可引起巨细胞包涵体病[4-5,9]。

最近有学者发现HCMV感染存在于人类多种不同类型的肿瘤组织中，Cobbs CS[8]等人采用免疫组化法对不同级别脑胶质瘤组织中 HCMV IE1-72抗原的表达进行分析，结果显示抗原阳性率为100%。Mitchell DA[13]等研究发现， 90%以上的胶质母细胞瘤组织中可检测到 HCMV基因组及其蛋白。Harkins等[14]研究发现在32例原发性和浸润性导管癌的上皮肿瘤中，运用免疫组化方法检测到97%出现HCMV IE的表达。同时Harkins等[15]也检测了来自45份结肠息肉、结肠腺癌患者病变组织、病变相邻组织及正常黏膜组织的标本，结果发现结肠腺癌患者的HCMV IE1-72抗原检出率为80%，而对同一患者肿瘤毗邻的以及远离肿瘤的正常结肠黏膜的HCMV IE1-72抗原检测却为阴性。尽管如此，HCMV感染与脑胶质瘤的关系目前仍存在较大争论，部分学者通过免疫组化、巢式PCR、原位杂交等技术在脑胶质瘤组织中却不能检测到该病毒的表达[16-18]。本研究通过免疫组化法发现76.4%细胞核和(或)细胞质中出现HCMV IE1-72蛋白阳性表达，其中75.0% II级星形细胞瘤、70.9% III级星形细胞瘤以及84.6%胶质母细胞瘤组织中出现阳性表达；但在对照脑组织标本中没有发现HCMV IE1-72蛋白阳性表达，脑胶质瘤组织与对照脑组织的表达有显著性差异(P<0.05)，本研究与Mitchell DA、Cobbs CS[8,13]等研究一致。同时本研究结果发现不同级别脑胶质瘤中HCMV IE1-72蛋白表达差异性没有统计学意义，在高级别脑胶质瘤(Ⅲ～Ⅳ级)细胞核及细胞质中却有较高的HCMV IE1-72蛋白表达。这些研究结果表明了 HCMV 感染在胶质瘤的发生发展中产生影响。但我们通过进一步生存分析发现HCMV IE1-72蛋白表达水平与胶质瘤患者的PFS无相关性(P>0.05)。

前期一些研究成果发现HCMV感染人体后，可以潜伏于宿主的特定细胞，形成持续的潜伏感染，与宿主长期共存并且还可以对宿主细胞的增殖、分化、迁移、侵袭等产生影响[8]。我们认为HCMV感染在脑胶质瘤的发生发展中起到一定的作用，但HCMV感染对脑胶质瘤细胞的增殖和侵袭的影响是一个复杂的过程，本研究可以为理解胶质瘤的形成和进展机制提供理论依据，并可以为治疗胶质瘤提供新的有效靶点。