血管性痴呆大鼠海马区域GABABR1表达的时空变化

魏礼洲 刘卫平 伊西才 黑悦

(空军军医大学西京医院神经外科，陕西 西安710032)

近年来我们和其他相关研究发现永久性双侧颈总动脉结扎模型(bilateral common carotid artery occlusion, BCCAO)可以很好的模仿血管性痴呆(vascular dementia, VaD)相关认知功能障碍以及慢性全脑缺血[1]。而海马区域椎体神经元是VaD引起的认知功能障碍重要靶点，而其中γ氨基丁酸能系统(GABAergic system)的选择性调控对认知改善有十分积极的作用。抑制性神经元突触中GABA B 型受体1(GABA type B receptor 1, GABABR1)的表达是该系统的重要组成部分，在GABA神经递质的合成和功能发挥中扮演重要角色[2-4]，近年研究发现对该受体的调控能够引起细胞外GABA水平和认知功能的改变，可能参与了血管性痴呆的病理生理过程，但尚未有相关文章探究该受体表达的时空变化。

本实验采用双侧颈总动脉结扎制作血管性痴呆大鼠模型，在3 d、14 d、28 d 三个时间点使用免疫印迹分析整体海马中GABABR1蛋白表达，用间接免疫荧光分析大鼠海马CA1、CA3和DG区域空间表达变化以此阐明GABABR1表达的时空变化，为针对该受体的进一步功能研究奠定基础。

材料与方法

一、实验动物和分组

全部健康成年Sprague Dawley(SD)大鼠(雄性，230～250 g)50只，由空军军医大学实验动物中心提供。实验动物随机分为正常组(n=20)和模型组(n=30)。遇到有造模失败或死亡，则将另外补充。

二、大鼠血管性痴呆模型的制作

造模前适应性喂养1 w，术前12 h禁食，采用永久性双侧颈总动脉结扎制作大鼠血管性痴呆模型。大鼠腹腔麻醉(10%水合氯醛，3 mg/kg)，仰卧位固定，于颈部正中做1.5 cm切口，暴露并分离双侧颈总动脉，注意尽量不牵扯迷走神经，取7号线于颈总动脉近远心端做2处方结，做永久性结扎。术后6 h以Longa五级四分法评分为1～3分者为模型建立成功。

三、大鼠脑组织标本制备及GABABR1间接免疫荧光染色

模型建立后第28 d取大鼠(模型组、假手术组各6只)，用200 mL生理盐水灌注后用4%多聚甲醛灌注固定。常规石蜡包埋，冠状切片(厚度为2 mm)。石蜡切片常规脱蜡止水，pH=6.0的柠檬酸修复液进行抗原修复；磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution, PBS)漂洗3次，每次6 min；加入0.3% H2O2溶液封闭内源性过氧化酶15 min；PBS漂洗3次，每次6 min；加入驴血清封闭1 h后甩去血清加入兔抗GABABR1(1 ∶400, Abcam, 美国)抗体，在4 ℃冰箱中孵育过夜,洗脱。使用山羊抗兔Alexor Fluor 488-结合的二抗(1 ∶1 000, 美国)以及4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4', 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色液(1 ∶1 000, 美国)，室温孵育2 h。分两人在荧光显微镜下观察，规划海马的相应划分，在每只大鼠随机观察10个切片，随后分别进行统计，并取平均值。

四、大鼠海马区域GABABR1的Western blot检测

各组大鼠(模型组、假手术组各6只)麻醉状态下经左心室持续灌注200 mL 0.01 moL/L PBS后，在冰上断头轻柔分离双侧大鼠海马组织加入强效组织裂解液1 mL提取蛋白，进行蛋白定量(西安鼎国)。配制10%十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE)，按80 μg总蛋白上样量上样，5%浓缩胶、10%分离胶电泳后，100 V电压2 h将蛋白转移到硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane)上，丽春红染色预染条带，1×三乙醇胺缓冲盐水溶液(tris buffered saline and tween, TBST)洗3×5 min，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，1×TBST洗3×5 min。而后使用GABABR1(1 ∶400, Abcam, 美国)抗体在4 ℃冰箱中孵育过夜，加入二抗后辣根过氧化物酶显色。使用计算机-荧光扫描仪系统扫描底片而后用Image J统计分析。

五、统计分析

结 果

一、 免疫印迹实验

血管性痴呆模型的海马CA1区GABABRs蛋白表达水平也呈现相应的双向变化，实验组相比假手术组，GABABR1 蛋白表达水平在3 d显著下降，并与28 d有部分回升(P<0.05, 3 dvs假手术组,P<0.05, 28 dvs3 d)。

二、免疫荧光实验

与免疫印迹结果相对应，大鼠海马CA1区GABABRs 荧光表达水平也呈现双向变化。在荧光镜下计数至少10个以上的高倍视野进行统计分析(如图2所示)。模型组GABABR1阳性细胞相比假手术组，在3 d时间显著下降(P<0.05)，而后与28 d时间点相比3 d有所回升(P<0.05)，而GABABR1的表达在CA3和DG区域并无统计学差异。

图1 各个时间点海马整体GABABRs蛋白表达水平变化

Fig 1 GABABR1 relative protein levels of the whole hippocampal area at different time points

A: The Western blot of the GABABR1 protein and β-actin; B: The statistical analysis of the bands.

aP<0.05,vsModel group;bP<0.05,vsModel group 28 d.

N=6 per group.

图2 GABABRs各个时间点间接免疫荧光染色

Fig 2 Immunofluorescence staining results of GABABR1 at different time points

A: Representative images of GABABR1 positive cells in the hippocampal CA1 subareas of both sham and model group; B: The quantification analysis of the immunofluorescence staining. No significant difference was found in CA3 and DG subareas in the hippocampus.

aP<0.05,vsModel group;bP<0.05,vsModel group 28 d.

N=6 in both groups. Scale bar=40 μm.

讨论

血管性痴呆为老年痴呆的主要类型之一，其认知障碍由脑组织血液循环障碍引起[5]，而双侧颈总动脉结扎(BCCAO)手术能够很好复制疾病机制，引起血脑屏障破坏、认知功能下降以及神经元损伤等[6]，是近年来使用频率最多且被广泛认可的血管性痴呆动物模型之一[5,7-8]。相比于大鼠的前额的皮层区域，海马与大鼠的长期记忆以及长时程增强(long-term potention, LTP)相关[9]，其CA1区域的神经元凋亡已被众多研究所证实[10-12]，并且CA1区域的神经元数量可能与大鼠认知水平和手术死亡率直接相关，其中GABA能神经元占有重要的位置。GABA能系统缺陷在阿尔兹海默氏病，癫痫以及慢性缺血性脑损伤中都有报道。

GABABR1在大脑发育的各个阶段均扮演重要位置，海马区域细胞发育早期，作为GABA能系统的最后功能组分，部分决定了神经元分化等一系列过程。有研究表明，血管性痴呆模型中该受体在海马CA1区域表达明显降低，但并未系统分析其时空表达变化。本实验发现其在3 d时下调，并于28 d时有所回升。此种时间依赖性的动态变化，说明急性期的应激反应(如活性氧、炎症反应等)极有可能对受体表达也有重要的调控作用[13]。血管性痴呆的慢性期，随着应激反应减轻和神经网络的重塑，GABABR1有部分上调。此外，该受体在认知过程的作用近年来也有报道。激活该受体可引起环化核苷酸门控阳离子通道蛋白HCN1/HCN2的表达失衡，从而对认知起到积极作用；定位方面，其在海马区域可能主要表达于小清蛋白(parvalbumin, PV)中间神经元中，并且用相应的抑制/激动剂能够起到认知调控作[14]。

本实验通过建立BCCAO的大鼠血管性痴呆模型，在3 d、14 d、28 d 三个时间点使用免疫印迹和间接免疫荧光分析了大鼠海马GABABR1在不同时间(3 d、14 d、28 d)和海马不同位置(CA1、CA3和DG)表达的变化，发现该受体在海马整体水平在造模后3 d迅速下降至低点，而后缓慢增高并在28 d时候相比急性期(3 d)有所回升，荧光染色发现该现象可能是由于CA1区域的GABABR1表达变化所致，以上现象并未在CA3和DG区域均无显著性差异。本实验为进一步探究该受体的功能奠定了基础。