节肢动物体内网格蛋白的研究进展

旷策嫣，周荣琼，周金林

（1.西南大学动物科学学院，重庆 402460；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

1 网格蛋白

网格蛋白（clatrin）被发现以来，人们对于该蛋白的形态、结构与功能一直在进行不断地探索。研究表明网格蛋白广泛存在于多种生物中，是一种笼形结构蛋白，分子大小约180 kDa，主要介导营养物质、病毒、细菌等进入生物体内。

1.1 网格蛋白的发现1975年，Pearse[1]无意间在显微镜下观察到了西红柿切片样结构，该结构与1970年Kanaseki和Kadota[2]描述的“形似篮子的水泡样结构”相似。随后对涂层囊泡纯化并进行SDS PAGE分析，证明该分子为大小约180 kDa的单一蛋白质，即现在所熟知的网格蛋白[1]。

1.2 网格蛋白的结构对于网格蛋白涂层囊泡的结构研究可以追溯到1964年。Roth等[3]在观察蚊子卵母细胞摄取卵黄蛋白的过程中发现了涂层囊泡，他们认为网格蛋白的结构是由自然排斥力产生的，而非机械作用。Kanaseki等[2]观察分离的涂层囊泡后，将其描述为一种由六边形转为五边形的球体。1976年，Pearse等[4]对网格蛋白涂层囊泡进行了高纯度的分析纯化，发现网格蛋白为12个五边形和若干六边形组成的笼形。1980年，Heuser[5]首次在电镜下观察到了网格蛋白为六边形组成的球形。

1979年，Keen等[6,7]通过分离提取网格蛋白，发现其中不仅含有高分子低聚物，还存在另一种较低分子量的蛋白质，低分子量蛋白可辅助高分子量蛋白组装，随后他将低分子量蛋白命名为“组装多肽”或“衔接蛋白（adaptor proteins，APs）”。随着科学家们的深入研究，网格蛋白由轻链和重链形成的三足结构也在1981年被揭示[8]。

1.3 网格蛋白的功能科研工作者对网格蛋白的功能研究进行了不断地探索，其中最为熟知的是网格蛋白介导的内吞作用。网格蛋白介导的内吞作用是“货物”借助网格蛋白外壳包裹入囊泡的入胞方式，是蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂质相互作用的高度协调的级联，在高等真核生物中具有神经传递、信号转导和许多质膜活性调节等功能[9]。网格蛋白结构非常保守，在多细胞生物体内如果发生变异，对多细胞生物会产生非常有害甚至是致命的影响。在不同生物体内，网格蛋白形成的囊泡大小不同。在多细胞生物中网格蛋白主要参与内吞作用，而该功能对于单细胞生物中可能并不是必需的。

2 网格蛋白的内吞机制

网格蛋白的内吞机制主要依赖于包裹“货物”的囊泡的形成、断裂与回收。囊泡形成的形态学阶段是通过各种蛋白质复合物的形成来反应的。通过对超微结构和细胞生物学的观察，可以将其大致分为五个阶段：起始、货物选择、涂层组装、断裂和脱壳，不同生物体网格蛋白的内吞过程有一定的差异。

2.1 起始形态学观察显示，在起始阶段，网格蛋白囊泡形成凹坑的膜内陷。参与该阶段的蛋白复合物包括FCH结构域（Fer/Cip4 homology domain only proteins，FCHO）蛋白、EGFR途径底物15（epidermal growth factor receptor pathway substrate 15，Eps15）和交叉蛋白[9,10]。蛋白复合物聚集在网格蛋白囊泡形成的凹坑内，其中Eps15具有多个衔接蛋白-2（adaptor protein-2，AP2）的结合位点，可以招募货物选择阶段中的核心蛋白AP2，从而与网格蛋白进行衔接。

2.2 货物选择在网格蛋白介导的内吞途径中，囊泡内除网格蛋白以外，最丰富的蛋白是AP2，该蛋白能特异性作用于质膜[10]。AP2蛋白通过μ亚基和σ亚基直接与跨膜受体的细胞质尾部中的序列相互作用，并使用其附属的结构域间接连接货物与衔接蛋白[11]。AP2可以结合网格蛋白和多种辅助蛋白，从而与货物特异性衔接蛋白一起介导货物的选择。在网格蛋白包被的凹坑中，AP2蛋白起到了与其他蛋白互作的核心作用，也在质膜上囊泡的形成中起到关键作用[12,13]。研究表明，参与该阶段的还有装配蛋白-180（assembly protein，AP180），其N-端同源结构域也可以与其他蛋白相互作用[14]，不仅参与调控囊泡中网格蛋白的高效组装，而且对于囊泡蛋白质的回收也十分重要。FCHO蛋白同样也具有与配体结合的结构域，所以货物具体选择的时间可能发生的更早。

2.3 涂层组装由于货物、AP2或货物特定的衔接蛋白选择和结合后是裸露的，因此需要组装网格蛋白外壳，货物才可以由囊泡包裹进入细胞。网格蛋白的聚合使膜弯曲，导致涂层凹坑内陷。网格蛋白由AP2蛋白聚集后，其三足结构从细胞质中汇集到细胞膜上，在合适的位点与组织形成包裹货物的囊泡凹坑。在这一阶段，有许多蛋白附着在囊泡的边缘，对囊泡的弯曲与稳定起到一定的作用，例如，起始阶段的Eps15和内吞适配蛋白Epsin[15]；另外一些衔接蛋白，如AP2、AP180和Epsin与网格蛋白一起互相作用，形成柔性区域从而使质膜变形。

2.4 囊泡断裂网格蛋白在形成凹坑以后，BAR结构域的蛋白质将募集发动蛋白Dynamin GTP水解酶。Dynamin是一种机械化学酶，在网格蛋白包被囊泡出芽过程中起决定性作用[16]。另一方面，囊泡断裂是一个GTP-依赖的构象变化过程。Dynamin经历GTP水解后发生了构象的改变，可能有助于Dynamin介导囊泡断裂[17]。

2.5 脱壳与网格蛋白的回收网格蛋白外壳主要是通过热休克同源物70（heat shock cognate protein，Hsc70）及其辅助因子、辅助蛋白（Auxili）或非神经元组织中的细胞周期蛋白G相关激酶（cylin G associated kinase，GAK）等相互作用，将其形成的网格蛋白晶格排列结构分解为基础的三足结构[9,18]。游离和未被网格蛋白包裹的囊泡将进入至靶内体中并与其融合。网格蛋白的三足结构在网格蛋白囊泡出芽后募集Auxili，再由Auxili募集HSC70以获得最大解体[19,20]，脱壳以后，网格蛋白被释放至细胞质中，待下一轮网格蛋白囊泡形成过程中被重新使用。

3 网格蛋白的内吞作用在节肢动物中的研究

作为许多病原体的载体，节肢动物在自然界中具有一定的特殊性。研究发现病原体或者其他物质能够通过网格蛋白介导的内吞作用进入节肢动物。目前对于网格蛋白在节肢动物中的研究仅限于个别亚门。

3.1 昆虫纲

3.1.1 果蝇 研究人员对网格蛋白在果蝇体内介导的内吞作用进行了观察与验证，发现了这一作用涉及到的相关蛋白以及这些蛋白与网格蛋白的关系。

网格蛋白在果蝇的生殖和产卵过程中具有至关重要的作用。1993年，Bazine等[21]对果蝇中的网格蛋白重链进行了克隆，发现它与哺乳动物及酵母的同源性高达80%，且该基因位于X染色体上，在精子的发生中具有特殊的作用。结合之前对于卵黄蛋白的分析，他们认为网格蛋白对正常分子的内化、分选、加工、分泌以及特定细胞类型中的分化、运输及发育具有至关重要的作用。2009年，Wingen等[22]通过免疫荧光清晰的观察到网格蛋白重链在果蝇幼虫与胚胎中的表达，同时，免疫荧光标记显示其与反式高尔基体网络部分接触，与早期内吞作用的标记物共定位。2014年，Jha等[23]观察到在黑腹果蝇卵室内卵黄发生过程中，由网格蛋白介导的内吞积累卵黄，可溶性分子被吸收到卵黄发生的现象。

作为模式生物，果蝇体内网格蛋白介导的内吞作用机制同样引发了研究人员的兴趣。在哺乳动物体内参与网格蛋白介导内吞途径中的分子，如衔接蛋白、Dynamin、Hsc70、Auxili等，在果蝇中也具有一定的生物功能。Burgess等[24]发现，衔接蛋白-1（adaptor protein，AP-1）和网格蛋白对果蝇的分泌颗粒的生物发生十分重要，而分泌颗粒是调节激素、消化酶和其他生物活性分子的分泌所必需的。另一种衔接蛋白GGA在高尔基体和内吞途径之间许多重要跨膜蛋白的细胞内分选中起作用。Hirst等[25]报道GGA在果蝇的头部和睾丸中高度表达，但对GGA进行干扰以后并未对其精子发生造成影响，可能是由于GGA与AP-1作用相似，AP-1替代了GGA的功能。Liu等[26]在研究卵黄蛋白进入卵母细胞的过程中发现，果蝇卵母细胞中有效的内吞摄取和成熟需要Dynamitin/p50，卵黄蛋白只有通过内吞途径被运输，并储存在浓缩的蛋黄颗粒中，才能用作发育中胚胎的食物来源。Chang等[27]研究表明在Hsc70突变后，网格蛋白脱壳活性降低，很可能抑制了网格蛋白囊泡的脱壳，对网格蛋白介导的内吞作用有一定的影响。Zhou等[28]研究表明Auxilin是Hsc70的辅助蛋白，是网格蛋白的调节因子，与网格蛋白和Hsc70一样，在果蝇精子发生的过程中具有重要作用。Auxilin参与网格蛋白囊泡的构成，以产生足够的质膜用于精子细胞形态发生。它还参与精子的发生，雄性不育可能是由于其辅助作用缺失造成的。

3.1.2 家蚕 研究表明，家蚕中肠对蛋白质的吸收依赖网格蛋白介导的内吞作用。Casartelli等[29]在家蚕幼虫中肠的培养物中，利用共聚焦激光扫描显微镜研究了柱状细胞负责异硫氰酸荧光素（FITC）-白蛋白内化的机制。巨蛋白在许多哺乳动物上皮细胞中的功能是摄取各种分子，包括白蛋白。巨蛋白受体需要Ca2+进行白蛋白内化，并可被庆大霉素抑制。Western blot分析和共定位实验显示，网格蛋白和白蛋白在顶端质膜的微生物区域中共定位。使用标记的白蛋白摄取作为增加的蛋白质浓度，函数显示，摄取方式遵守饱和动力学，米氏常数值为（2.0±0.6）μmol/L，与受体介导的内吞作用相关数据相符。使用内吞抑制剂后，摄取白蛋白的速率显著降低。可见，FITC-白蛋白内化是网格蛋白介导的。

Feng等[30]发现，家蚕核多角体病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，BmNPV）的芽生病毒（Budded virus，BV）通过低pH依赖性内吞作用途径进入BmN细胞。经抑制试验、透射电子显微镜（TEM）分析和小干扰RNA（siRNA）敲低测定揭示，BV进入BmN细胞是由网格蛋白依赖性内吞作用介导的。此外，通过siRNA抑制Rab5、Rab7或Rab11证明BV需要早期和晚期内体用于BmN细胞感染的内吞作用。

3.1.3 甲虫 甲虫体内网格蛋白介导的内吞作用主要是针对dsRNA的研究。Xiao等[31]通过注射赤拟谷盗（Tribolium castaneum，Tc）中的标记基因-幼虫巨大致死基因（lethal giant larvae，TcLgl）的dsRNA，使用不同内吞途径的药理学抑制剂与RNAi结合，证明网格蛋白依赖性内吞作用的两种抑制剂（氯丙嗪和巴弗洛霉素-A1）可以显著减少TcLg1的RNAi，且通过RNAi在网格蛋白依赖性内吞作用中的相关蛋白（TcRab7）可显著损害TcLg1的RNAi。这些结果证实网格蛋白依赖性内吞作用是T. castaneum中细胞摄取dsRNA的主要机制。

3.1.4 伊蚊 20世纪90年代，研究人员对伊蚊体内网格蛋白的分子结构和生物化学进行了研究，证明蚊子体内网格蛋白的存在[32]，并对网格蛋白进行了克隆。分析发现伊蚊体内网格蛋白与哺乳动物之间的同源性要高于线虫，由此推测高等生物之间网格蛋白介导的内吞作用具有相似性[9]。

1997年，Kokoza等[33]在对伊蚊卵黄发生的研究中发现，网格蛋白在卵母细胞中高度表达，并参与了卵黄发生和卵黄蛋白原的产生。网格蛋白在伊蚊卵母细胞中持久且稳定的表达很可能是为其产卵做准备：伊蚊吸血后，卵巢中网格蛋白的表达量逐渐升高，通过大量的内吞作用吸收营养以维持卵泡的发育。

网格蛋白不仅对伊蚊的发育和产卵有一定的影响，而且可以通过内吞作用作为载体传播病毒。2008年，Acosta等[34]使用生物化学和分子抑制剂，通过共聚焦和电子显微镜首次观察致登革病毒2（DENV-2）进入伊蚊的C3 /C6细胞。在酸性环境中DENV-2通过受体介导的网格蛋白依赖性内吞作用进入昆虫细胞，揭示了黄病毒在昆虫细胞培养物中的进入模式，也代表了昆虫作为载体在自然界中的进入途径。同年，Mosso等[35]使用DIL标记的病毒粒子和实时成像的方法再次证明了Acosta的观点，并且证实登革热病毒不需要从早期到晚期内体转运。通过分析发现，病毒通过内吞囊泡进入细胞仅依赖于渗透压，这种方式恰好可以降低免疫监测的风险，并且酸性环境更有利于病毒膜的融合。2013年，科研人员利用伊蚊的C3 /C6细胞对伊蚊传播基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV），他们通过投射电镜观察到在质膜内陷中存在CHIKV颗粒，类似于网格蛋白包被的凹坑。参与CHIKV内吞运输过程的囊泡的现象揭示了病毒颗粒先进入早期内体，随后转移至晚期内体和溶酶体，他们首次揭示了CHIKV进入蚊子细胞的感染性进入是由网格蛋白依赖的内吞途径介导的[36]。

研究显示，网格蛋白介导的内吞作用还会对细菌的毒素有一定的作用。内吞作用是昆虫细胞用来应对成孔毒素的一般机制，它是由网格蛋白和flotillin介导的[37]。

3.1.5 虾 网格蛋白介导的内吞作用可能是中小型病毒内吞作用的最常见机制[38]。2013年Jatuyosporn等[39]在对黑虎虾（斑节对虾）的研究中发现，能够感染黑虎虾的黄头病毒（Yellow head virus，YHV）是通过网格蛋白介导的内吞途径进入的，并且内吞作用还参与了黑虎虾体内YHV的繁殖。网格蛋白外壳AP17基因被敲低后，YHV复制显著降低。使用网格蛋白介导的内吞途径的抑制剂——氯丙嗪预处理虾，YHV感染率显著下降。

白斑综合征病毒同样是以网格蛋白依赖性方式进入日本对虾（Marsupenaeus japonicus）的血细胞中。Yang等[38]首次发现日本对虾的C类清道夫受体（scavenger receptors，SRCs）寡聚化后，细胞内募集结构域结合日本对虾的β-抑制蛋2，以网格蛋白依赖性方式启动血细胞对白斑综合征病毒的吞噬作用。病毒最终在血细胞吞噬溶酶体中降解，有效地限制了对虾体内的病毒感染。

3.1.6 蚜虫 昆虫不仅能够传播动物病原体，还可以做为植物病原体的携带者，对经济作物造成严重的影响。蚜虫是传播植物病毒的重要载体。Brault等[40]运用透射电子显微镜观察黄体病毒在蚜虫体内的转运，在蚜虫肠道细胞的各种囊泡结构中都观察到病毒粒子。经肠道细胞胞吐后，病毒体被释放进入蚜虫的体腔中，与共生蛋白（一种内共生蛋白）结合。

3.1.7 虱 虱作为植物病毒的传播媒介，体内植物病毒的转运也已被研究。在对虱体内的番茄黄叶卷曲病毒（Toamtos yellows leaf curl virus，TYLCV）的研究中，发现在粉虱的中肠上皮细胞的囊泡样结构中可以检测到TYLCV。Pan等[41]通过饲喂抑制剂、抗体阻断和dsRNA沉默抑制网格蛋白介导的内吞作用，鉴定网格蛋白在该过程中的作用。研究结果表明，膜状囊泡被生物病毒募集进入载体中肠细胞，表明TYLCV可以通过网格蛋白依赖途径内化到中肠细胞中，并且内体系统可能在粉虱中肠的病毒转运中起重要作用。Xia等[42]通过使用RNAi和抑制剂破坏囊泡运输，证明了囊泡运输的早期对于粉虱中肠中TYLCV的胞内转运十分重要。与许多动物病毒不同，TYCLV以回收内体、晚期内体、溶酶体、高尔基体和内质网等方式在细胞内单独存在并被囊泡运输。

3.2 蛛形纲

3.2.1 螨 Wu等[43]对螨的网格蛋白dsRNA进行了研究，发现网格蛋白对西方盲走螨的生殖、产卵有很大的影响。以饲喂方式处理螨的网格蛋白的dsRNA，会严重影响螨的产卵率和孵化率。饲喂网格蛋白dsRNA后影响了螨全身RNAi反应，总mRNA的表达量发生了明显的下降。结果表明在螨中网格蛋白基因的敲除可能具有广谱效应，可影响螨体内其他基因的转录调控。

3.2.2 蜱 近年来，外泌体成为研究热点。2018年，Zhou等[44]对蜱传兰加特病毒（Langat virus，LGTV）的外泌体进行研究，用网格蛋白特异性抑制剂（Pitstop-2）处理N2a细胞，并用LGTV感染的N2a细胞的外泌体再感染Pitstop-2处理后的细胞，发现与DMSO处理的对照组相比，Pitstop-2处理的细胞中LGTV显著减少。结果表明外泌体介导的LGTV向细胞的传递是由网格蛋白依赖性内吞作用介导的。

4 讨论

网格蛋白介导的内吞作用不仅对节肢动物的生殖和发育具有很重要的作用，而且在营养物质的吸收、dsRNA的干扰、病毒的传播中也起到非常关键的作用。节肢动物作为传播病毒的媒介昆虫，研究其内吞作用在控制疾病传播方面具有十分重要的意义。

目前研究人员仅对果蝇网格蛋白介导的内吞作用的相关蛋白进行了鉴定，该通路在其他节肢动物的具体作用并无相关研究论证。在节肢动物对内吞作用的研究更侧重于病毒的作用机制，对其本身营养物质的吸收关注较少。哺乳动物中网格蛋白对纺锤体的形成具有重要作用，但节肢动物中并无相关报道。在网格蛋白介导的内吞作用研究中，可以构建内吞作用网络，从整体角度研究其作用机制以及对节肢动物其他方面的影响。