犬弓首蛔虫衡阳分离株的核糖体DNA ITS序列分析

文贵辉，刘振湘

（湖南环境生物职业技术学院,衡阳 421005）

犬弓首蛔虫（Toxocara canis）属于蛔虫目（Ascarididea）、弓首科（Toxocaridae）、弓首属（Toxocara），是犬的常见寄生虫，成虫主要寄生于肉食兽的小肠内。犬弓首蛔虫主要危害2周至5月龄的幼犬，引起幼犬发育不良，生长缓慢，严重时可导致死亡[1]。犬弓首蛔虫也可感染猫、鹌鹑、鸵鸟以及猪等动物[2-5]。作为一类常见的人畜共患性寄生虫病，犬弓首蛔虫对人类健康存在严重威胁，其幼虫能在人体内移行，引起人体内脏幼虫移行症、眼睛幼虫移行症、隐性弓首蛔虫病和非化脓性脑膜脑炎等疾病综合症[6,7]。

犬弓首蛔虫在全世界分布广泛，感染率为5.3%～64.7%。我国的犬弓首蛔虫病感染率为8.13%～77.4%。近年来，宠物犬饲养量剧增，弓首蛔虫病感染率也呈逐年上升趋势[8]。同时，犬弓首蛔虫对犬、猫等动物的健康成长产生了极大的危害，给相关养殖业带来了巨大的经济损失。本研究对湖南省衡阳市犬弓首蛔虫流行感染情况进行调查，通过对犬弓首蛔虫核糖体ITS序列进行PCR扩增和序列分析，探讨与其他蛔虫的种系发育关系，旨在为犬弓首蛔虫的分类、鉴别诊断和分子流行病学调查等研究提供参考，同时为犬弓首蛔虫疾病的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品收集在湖南省衡阳市随即采集犬粪样共453份，其中从蒸湘区、石鼓区、雁峰区、珠晖区和南岳区宠物医院采集的犬粪样品数分别为36份、31份、33份、33份和31份，共164份；从以上地区采集野外犬粪样品数量分别为72份、58份、57份、53份和49份，共289份。

1.2 主要试剂DNA提取试剂盒WizardTMDNA Clean-Up System购自Omega生物技术公司；PCR试剂（Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP等）、DL2000 Marker等均购自大连宝生物工程有限公司；蛋白酶K为Merck公司产品；引物由上海华大基因有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 形态学鉴定与虫卵DNA提取 应用饱和盐水漂浮法对所获得的犬粪便进行犬弓首蛔虫虫卵检测。对采用饱和食盐水离心漂浮法获得的样品漂浮液面进行镜检。若3次均未发现犬弓首蛔虫虫卵，即判定为阴性，若1次发现犬弓首蛔虫虫卵，则判定为阳性。对阳性样品中虫卵进行富集，并提取虫卵DNA基因组[9]。

1.3.2 引物设计与PCR扩增 采用文献[10]中引物用于扩增弓首蛔虫卵与狮弓蛔虫卵核糖体ITS部分序列，引物序列为：NC5：5'-GTAGGTGAACCTGCGGAA GGATCATT-3'（26 bp）；NC2：5'-TTAGTTTCTT TTCCTCCGCT-3'（20 bp），进行弓首蛔虫ITS基因序列扩增，预期片段长度为885 bp左右。50 μL反应体系：10×PCR Buffer 8 μL、MgCl2（25 mmol/L）5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）4 μL、rTaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL、上下游引物（50 pmol/μL）各1.0 μL、DNA模板4 μL和ddH2O 24.5 μL，混匀后短暂离心15 s。同时，以双蒸水代替DNA模板作空白对照。反应条件：94℃预变性5 min；然后94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环；最后72℃延伸5 min。反应结束后取5 μL扩增产物于1% TAE琼脂糖凝胶电泳观测目的条带，将阳性产物直接送至上海华大基因有限公司进行测序。

1.3.4 数据分析 对测序结果用DNAStar5.0软件进行分析，下载GenBankTM收录的所有不同国家/地区具有代表性的弓首蛔虫的ITS基因序列，然后对其进行相似性对比，与其他蛔虫种系发育分析，用Clustal X 2.0 软件和Mega 7.0软件对获得的5株弓首蛔虫和从GenBankTM中下载的蛔虫ITS序列进行比对，计算遗传差距。利用Mega 7.0程序中的邻位相连法（neighbor-joining，NJ）绘制种系发育树。

2 结果与讨论

2.1 衡阳市犬弓首蛔虫感染情况调查结果

2.1.1 衡阳市宠物犬弓首蛔虫感染调查结果 通过对衡阳市453份犬粪样品进行犬弓首蛔虫感染情况调查，结果发现有60份样品检测为犬弓首蛔虫病阳性，平均阳性率为13.28%（60/453）；164份宠物犬粪便样品中有28份检测为犬弓首蛔虫病阳性，阳性率为17.07%（28/164）；野犬的弓首蛔虫病阳性率偏低，为10.38%（30/289）。本次调查结果明显高于长沙市和怀化市犬弓首蛔虫感染率调查结果[9]（4.89%），但低于益阳市犬弓首蛔虫感染率（54.9%）[7]。说明湖南省犬弓首蛔虫感染情况差异较大，分布较广，对人畜健康已形成较大的威胁，应该引起重视。

2.1.2 弓首蛔虫虫卵镜检结果 粪便样本中犬弓首蛔虫虫卵呈圆形，颜色较浅，虫卵内部存在空隙，轮廓较清晰[11]（图1）。

图1 犬弓首蛔虫虫卵镜检结果Fig 1 Examination of T.canis eggs by microscope

2.1.3 测序与序列分析结果 ITS基因由18S rRNAITS-1-5.8S rRNA-ITS-2-28S rRNA方式排列组成，其中18S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA基因属于高度保守区域，而ITS-1和ITS-2为高度变异区，在种内相对保守，种间具有显著的差异性。PCR 技术在寄生虫学方面已经得到了泛的应用[12]。采用 PCR 对寄生虫某段特异性基因片段的分析开创了寄生虫分类学的新纪元。研究表明，ITS基因序列可以作为理想的遗传标记，应用于寄生虫的分类鉴定、种系发育学和种间分类等分子学研究中[13-15]。

对5个犬弓首蛔虫衡阳市分离株的核糖体ITS基因序列进行扩增与分析，结果显示，所获得犬弓首蛔虫ITS片段大小为885 bp，其中A、T、C和G平均含量分别为25.34%、26.50%、19.54%和29.62%，A+T和C+G平均含量分别为51.84%和49.16%。在扩增的基因片段中，未出现碱基缺失和插入，仅存在核苷酸置换的现象。对获得的序列进行遗传差异分析，发现种内变异程度较低，为0.0～0.8%；与GenBank中收录的犬弓首蛔虫ITS序列分离株同源性最高，均高于98.4%；与其他蛔虫ITS序列相比，同源性较低，均低于62.0%。

2.1.5 ITS序列系统发生树 采用 Mega 7.0软件将本次所测定的序列与从GenBank中登录的其他弓首科和蛔科虫体的ITS基因序列进行对比分析，构建系统进化树。结果显示，5株犬弓首蛔虫分离株与来自日本和澳大利亚的3个犬源犬弓首蛔虫处于同一进化分枝上，与其他蛔虫所属分支距离较远，说明此次分离的虫株为犬弓首蛔虫（图3）。

图2 基于分离株ITS 基因序列构建的系统进化树Fig.2 Phylogenetic trees based on the ribosomal DNA ITS gene sequences using neighbor-joining (NJ) method

至今为止，关于寄生虫分类、鉴定及遗传变异的分子生物学方法已有很多报道[16-18]。宋美冉等[19]对于mtDNA上cox1、nad1和nad4三种序列进行了研究。研究结果显示线粒体基因突变率较高，相对而言mtDNA上序列对隐藏种的鉴定更为有效[20,21]。本研究基于ITS序列对衡阳市犬弓首蛔虫的种系发育关系进行鉴别，为今后犬蛔虫的分类、鉴别诊断和分子流行病学调查等研究提供了依据。目前，ITS进化方式的相关研究还不是很深入，不同重复序列究竟是如何保持一致等问题还在探究中[16]。