铝盐佐剂的安全性思考①

霍宇娟 郑源强 崔正荣 石艳春

(内蒙古医科大学内蒙古自治区分子生物学重点实验室，呼和浩特010058)

疫苗佐剂是预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的非特异性免疫增强性物质。它可以帮助抗原诱导长期和高效的特异性免疫应答并增强疫苗的效力，还可以减少抗原用量和免疫次数[1]。铝盐如氢氧化铝和磷酸铝等常用于人类疫苗中作为佐剂，但是铝盐作为疫苗佐剂也存在局限性。例如，通常认为铝盐佐剂只能增强特异性体液免疫应答，但不会增强特异性细胞免疫应答[2]。另外，虽然铝盐作为疫苗佐剂有将近一个世纪的历史，但有报告指出铝佐剂会引起局部不良反应的发生[3]。本文我们着重讨论铝盐作为疫苗佐剂的安全性问题。

1 铝盐佐剂

1.1铝盐佐剂的发现 1926年，Glenny等[4]首次发现铝盐沉淀的白喉类毒素(DT)悬液在豚鼠中比单独的DT具有更高的免疫原性。1932年，铝佐剂首次被用于DT疫苗的制备，提高了其免疫效果[5]。1939年，氢氧化铝佐剂的诞生实现了铝佐剂的商业化[6]。

1.2铝盐佐剂分类及特点 铝佐剂主要包括磷酸铝、氢氧化铝和硫酸铝钾三种，目前常用的铝佐剂为氢氧化铝和磷酸铝。根据制备过程不同，铝盐佐剂疫苗可分为铝沉淀疫苗和铝吸附疫苗，以往的疫苗多采用铝盐佐剂沉淀蛋白，而现在的疫苗普遍采用铝盐佐剂吸附纯化的蛋白[7]。

氢氧化铝是一种表面只有羟基基团的层状晶体，因其羟基可提供或接收质子，从而表现为两性化合物，在pH7.4的液中以阳离子形式存在，是阴离子抗原的良好吸附剂。磷酸铝在pH7.4的溶液中以阴离子形式存在，是阳离子抗原的良好吸附剂。不同铝盐的等电点(pI)存在差异，例如硫酸铝钾、磷酸铝和氢氧化铝的pI分别为0.5、5、11.4[8]。因此，疫苗制剂中铝盐的选择取决于抗原的性质和铝盐的pI值。

佐剂的稳定性对于疫苗的制备和储存至关重要。常温条件下，随着时间的延长，疫苗中铝佐剂的空间稳定性降低，因此在用铝盐作为疫苗的佐剂生产疫苗时就需要配伍适当的稳定剂。冷冻后的铝佐剂出现粒子聚集现象，在其中加入冷冻保护剂对佐剂具有保护作用[9]。

1.3铝盐佐剂在疫苗中的作用机制 尽管铝佐剂在疫苗生产中的应用已经90多年，但对其增强免疫反应的作用机理尚不清楚。较为公认的机制有储存库效应、促吞噬效应、炎性反应等。近年来，很多学者也进行了大量研究，从不同角度阐释了铝佐剂免疫增强作用的机理。通常认为是铝盐作为疫苗佐剂的主要作用机制，但确切的机制尚不清楚。

1.3.1储存库效应 铝佐剂吸附抗原后可减少注射部位抗原的流失，铝佐剂吸附的抗原在注射部位缓慢释放，从而延长抗原在体内的滞留时间，增强抗原与免疫细胞之间的相互作用，造成对免疫系统长久而有效的刺激，这种效应被称为“储存库效应”。但储存库效应也备受争议，最先提出质疑的是Holt等[10]，其研究发现，用铝佐剂沉淀的 DT注射豚鼠，7 d后切除注射部位的肌肉，铝佐剂在促进抗体产生上并没有显著差异。此外，注射铝盐疫苗24 h后在注射部位已检测不到抗原分布[11]。表明铝佐剂吸附抗原形成的仓储作用可能并非是铝佐剂发挥作用时必须通过的途径。

1.3.2免疫刺激效应 肌肉和腹腔注射铝佐剂后，在注射部位产生单核细胞、中性粒细胞以及嗜酸性粒细胞趋化因子，募集并趋化血液循环的中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞等炎性细胞至注射部位，单核细胞及未成熟的树突状细胞等摄取抗原，并分化为成熟的树突状细胞，进一步将抗原提呈给T淋巴细胞[12]。铝佐剂注射部位巨噬细胞的出现可能与嗜酸性粒细胞活化趋化因子配体CCL2和CCL4的表达量增加有关[13]。肥大细胞识别铝盐并释放IL-5、趋化因子配体2和其他细胞因子，从而将嗜酸性粒细胞招募到注射部位[14]。中性粒细胞在铝佐剂注射后迁移至注射部位，通过释放LL-37及天青杀素募集CD11b+单核细胞到炎症区域并分化为树突状细胞[15]，树突状细胞可识别外源性抗原，并将其降解成小肽段，通过 MHC 分子提呈给 T细胞受体，并提供必要的共刺激来激活CD4+T细胞或 CD8+T细胞[16]，随后，CD4+T 细胞辅助 B 细胞群转化成浆细胞。外周组织中未成熟的树突状细胞识别并捕获外源性抗原，迁移至淋巴结副皮质区转化为成熟的树突状细胞[17]，因此，树突状细胞在铝佐剂免疫刺激活性中发挥了重要作用。

1.3.3促进吞噬作用和淋巴细胞分化 Mannhalter等[18]比较了铝佐剂在巨噬细胞吞噬I125标记的白喉类毒素上的作用。结果表明在铝佐剂存在的情况下，巨噬细胞摄取白喉类毒素的速度至少提高了5倍以上，提示铝佐剂具有较好的促吞噬效应。Rimaniol等[19]通过研究发现当巨噬细胞吞噬氢氧化铝后，其表型和功能发生改变，更加类似于髓样树突状细胞并可诱导针对记忆应答的MHC-Ⅱ抗原特异性免疫应答。

Mannhalter 等[18]研究证明含有氢氧化铝佐剂的破伤风类毒素可使T细胞释放更多IL-1，而IL-1反过来可刺激T细胞分化增殖，证明了含铝佐剂疫苗可以诱导更强的免疫应答水平。

此外，经铝佐剂刺激，巨噬细胞产生 IL-1β、IL-6和前列腺素E2(PGE2)，PGE2除了可诱导T细胞分化，还直接影响B细胞，并促进IgE分泌。

1.3.4激活NLRP3炎性小体 直接因素和间接因素形成的NOD样受体蛋白3(NOD like receptor protein 3,NLRP3)炎性小体可以刺激炎性树突状细胞，促进抗原的摄取、加工和提呈，调节固有免疫应答和适应性免疫应答，以此发挥佐剂活性。氢氧化铝颗粒被内吞入细胞后，产生活性氧，导致溶酶体膜被破坏。活性氧和溶酶体破裂是NLRP3炎性小体的上游激活信号。此外，氢氧化铝具有细胞毒性，能诱导注射部位细胞死亡，死亡细胞释放的细胞内容物如尿酸可作为内源性危险信号，在间质组织中形成的高浓度尿酸晶体可间接作为激活NLRP3炎性小体的内源性危险信号[20]。

铝佐剂可通过激活细胞内NLRP3进而刺激巨噬细胞分泌高水平的促炎症因子，如IL-1β和IL-18。NLRP3炎性小体可刺激树突状细胞对抗原摄取、加工和提呈，调节免疫应答[21]。

1.4铝盐佐剂的应用 目前，铝盐佐剂广泛用于如人乳头瘤病毒疫苗、灭活脊髓灰质炎病毒疫苗、百日咳-白喉-破伤风三联疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、狂犬病疫苗、炭疽疫苗、b 型流感嗜血杆菌疫苗、b型嗜血杆菌结合疫苗、肺炎链球菌疫苗、脑膜炎疫苗以及兽用疫苗(如口蹄疫病毒疫苗和肉毒杆菌疫苗)。 以上疫苗的问世使肿瘤等各类相关疾病提前得到了预防，大幅度降低了发病率。但铝盐疫苗接种后也会产生一些不良反应，如注射部位红肿，发热等症状，但通常较为轻微，且具有自限性，尚未发现可归因于疫苗的死亡或瘫痪等严重不良事件。

1.5影响铝盐疫苗效应的因素

1.5.1抗原与铝盐佐剂的吸附率 现已证明，铝盐和疫苗抗原通过静电力、疏水作用力以及基团交换结合在一起[22]，可溶性抗原通过与佐剂结合变为颗粒性抗原，从而更有效地与抗原提呈细胞(APC)作用。早期研究表明，抗原与铝佐剂完全吸附，有利于疫苗的稳定性和有效性[23]。Chang等[24]使用吸附率分别为3%、35%和85%的3种铝佐剂溶菌酶疫苗免疫新西兰大白兔后，发现诱导的抗体滴度无显著差异，表明疫苗中佐剂的抗原吸附量差异对疫苗的抗体反应无显著影响。进一步研究发现，将以上3种疫苗与羊淋巴液混合后(模拟体内环境)，疫苗的吸附率均变为40%，表明影响铝佐剂免疫增强效果的不是铝佐剂在体外对抗原的吸附率，而是疫苗接种后在机体内的吸附率。但Hassett等[25]研究发现，人类免疫缺陷病毒HIV的gp140蛋白与铝佐剂吸附后，诱导产生的抗体量与吸附率呈负相关，即抗原的吸附率越高，诱导产生的抗体量越少。这可能是由于抗原与佐剂吸附过强导致抗原结构发生了变化。

1.5.2铝盐佐剂的剂量 铝盐剂量是疫苗开发需要考虑的至关重要因素，因为铝盐的剂量太低时，不能有效吸附抗原；而当铝盐剂量过高时，它可以抑制抗原的释放，从而抑制免疫反应[26]。此外，高浓度的铝盐会产生细胞毒性作用[27]。人用疫苗的铝含量通常为每剂0.5 mg[28]，WHO建议最大铝含量不超过1.25 mg/剂量。

关于疫苗中佐剂的铝盐含量与诱导的特异性抗体水平之间的剂量-反应关系，颜淑芹等[29]将同批人用狂犬病纯化疫苗分别加入氢氧化铝，最终浓度依次为 0.70、0.50、0.20 mg/ml，分别免疫小白鼠后，进行活狂犬病毒攻击实验，结果表明不同浓度铝佐剂对人用狂犬病纯化疫苗效力无影响。Theeten等[30]用低剂量(0.133 mg)，中剂量(0.3 mg)和高剂量(0.5 mg)铝盐佐剂的DTPa疫苗免疫青少年，研究发现各组对诱导的抗体阳转率无显著差异，但高剂量组疫苗抗体生成量高于低剂量组，这一结果提示在尽可能降低铝盐含量的同时还需考虑对抗体产生量的影响，即在不影响抗体产生量的前提下尽可能降低疫苗中的铝盐含量，这才是最佳疫苗配方。

2 铝盐佐剂疫苗的安全性

铝盐作为疫苗佐剂在人类疫苗中一直保持它的垄断地位，并已建立了不良反应低发生率的安全记录，但其安全性方面可能仍存在一些潜在问题[31]。

从免疫学角度来看，铝盐佐剂可诱导IgE介导的超敏反应。铝盐可引起注射部位的炎症并刺激局部红斑、肉芽肿和皮下结节。铝盐佐剂不能有效地增强Th1型免疫应答，它们干扰细胞免疫并阻断CD8+细胞的活化，使得疫苗的免疫力不完整和非持久[32]。

狂犬病疫苗使用铝胶作为佐剂，铝佐剂会延长延缓中和抗体产生的时间，但只诱导体液免疫应答，且有研究表明接种含铝佐剂狂犬病疫苗会产生神经损害及多种毒副作用，影响狂犬病疫苗快速产生保护性作用[33]。

HPV疫苗接种的不良反应与一般疫苗相似，严重不良反应率无统计学意义。部分研究报道HPV疫苗接种后出现不良反应，如局部皮肤红肿热痛、淋巴结肿大或超敏反应等，但属于个别案例，不具有统计学意义[34]。

研究表明，接种疫苗后大部分铝通过肾脏被迅速清除[35]。 然而，婴儿、老年人以及肾功能受损者容易发生体内铝的积累[36]。铝盐进入人体后首先沉积在大脑内，产生神经毒性作用[37]，表现为记忆力减退、注意力不集中、语言功能障碍和行为改变等，还可以表现为精神运动障碍、重复行为、语言障碍、睡眠障碍、癫痫发作、焦虑和注意力不集中、学习和记忆缺陷。此外，阿尔茨海默氏症、帕金森病痴呆、多发性硬化症都可能与铝积累毒性有关[38-40]。但含铝盐疫苗与这些疾病的直接关系尚需更多的证据。任何毒性都可能取决于佐剂、抗原和其他疫苗组分，此外还包括免疫接种人群的遗传背景、年龄和性别等，因此，要进一步得出铝盐疫苗安全性结论仍然需要进一步研究分析。

百分之百无风险的疫苗是不存在的，但目前尚无充足的证据证实铝盐佐剂存在毒性。铝盐疫苗使用过程中严重、快速的不良反应风险是非常低的，因此我们应该对现有疫苗的安全性有很高的信心。

3 铝盐佐剂疫苗的不良反应

尽管铝佐剂疫苗具有长期安全性记录，但它可引起不同程度的局部反应。对机体而言，佐剂是外源性物质，可能具有某些副作用。实际的或理论上的危险性主要有以下几点：局部反应，包括慢性炎症、脓肿、结节、溃疡；流感样症状；过敏反应；毒性；致癌作用及致畸作用[41]。

3.1局部不良反应和全身反应 铝盐佐剂疫苗会引起局部不良反应，如注射部位疼痛、红斑、硬结、肿胀、无菌性脓肿，淋巴结肿大和慢性皮肤溃疡。然而，这些反应通常是温和的且持续时间较短。此外，也有报道称铝盐佐剂疫苗会引起全身反应，如发烧、头痛、头晕、呕吐、腹泻、肌痛、关节痛和嗜睡症等。目前还没有证据表明疫苗中的铝盐会引起严重且持续的不良反应[42]。

以HPV疫苗为例，接种HPV疫苗(即每0.5毫升剂量含有约500微克铝的Gardasil-9)后常见不良反应包括局部轻微反应，如注射部位疼痛、发红、肿胀和轻微的全身不良反应如发热、头痛、头晕、肌肉或关节疼痛、胃肠道反应如恶心、呕吐及腹痛[43]，这些不良事件通常是暂时性和自愈性的[44]。

3.2自身免疫病与过敏反应 疫苗接种后，疫苗中的铝滞留在细胞中可能导致自身免疫病[45]。铝盐佐剂可以促进嗜酸性粒细胞和IgE的产生，增加过敏反应的风险。

3.3巨噬细胞性肌筋膜炎 有些人在接种铝盐疫苗后会发展成为巨噬细胞性肌筋膜炎(Macrophagic myofasciitis,MMF)。 MMF是由铝盐佐剂引起的慢性肉芽肿性炎症[46]。这是一种罕见的全身性肌肉疾病，铝剂滞留在肌肉组织中，引起持续的免疫反应，主要症状包括慢性疲劳，慢性弥漫性肌痛(肌肉无力)和关节疼痛[47，48]。

3.4疼痛综合征和自主神经系统功能障碍 目前关于HPV疫苗安全性的研究表明，HPV疫苗接种与罕见疼痛综合征和自主神经系统功能障碍之间可能存在因果关系[49]。在接种HPV疫苗的妇女中发现疲劳和头痛是最常见的症状。研究还发现[50]，大龄女孩(>35岁)可出现肌痛、乏力、精神萎靡、头晕、睡眠问题、咳嗽、气短和腹泻等症状。

3.5海湾战争综合征 海湾战争综合征困扰着许多西方退伍军人，他们的认知和行为缺陷类似于肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)，这是一种破坏神经细胞的进行性神经退行性病症。这些症状被怀疑与其接种铝盐佐剂炭疽疫苗有关[51]。Allen等[52]研究显示，海湾战争结束10年后，曾经接种疫苗的退伍军人对炭疽抗原保持T细胞记忆应答，有症状的退伍军人与健康军人相比，其NK细胞的数量和活性是降低的。

4 铝盐疫苗的发展趋势

虽然铝佐剂已应用多年，但仍具有很多限制性。随着免疫学、转录组学、表观遗传学、反向遗传学等技术的发展，不断涌现出许多新的疫苗，对疫苗佐剂的要求也越来越高，铝佐剂的改良更加引人关注。

4.1铝盐佐剂磷酸化 氢氧化铝佐剂的等电点为11.4，因此在生理pH值条件下带正电荷，对酸性蛋白质具有良好的吸附作用，对碱性蛋白质的吸附性差，可通过磷酸化作用降低等电点，增加其对碱性蛋白质的吸附活性。Flarend等[53]研究了通过肌内注射的方式分别将标记好的氢氧化铝基佐剂和磷酸铝基佐剂注射到兔体内，28 d后观察发现基于磷酸铝的佐剂更容易溶解。 Rinella等[54]研究发现，5 mmol/L磷酸根离子处理的氢氧化铝佐剂与2 mmol/L磷酸根离子处理的氢氧化铝佐剂相比，其对等电点为11.1的溶菌酶的吸附率由11%升高至39%。因此，磷酸化可以作为铝佐剂今后研究和拓展的一个方向。

4.2联合佐剂 铝佐剂与Toll样受体激动剂MPL(3-O-desacyl-4′-monophosphoryl lipid A,MPL)组成的联合佐剂目前已被批准用于HPV-16/18疫苗[55]和HBV疫苗[56]。HPV疫苗是使用最广泛的AS04佐剂疫苗(AS即Adjuvant system，是葛兰素史克公司的系列人用疫苗佐剂)，它含有HPV16 L1蛋白、HPV18 L1蛋白、氢氧化铝和MPL。MPL可以快速诱导局部细胞因子反应以激活APC，氢氧化铝可延长注射部位针对MPL的细胞因子反应，增强疫苗的免疫效应[57]。该疫苗具有良好的免疫原性，三剂疫苗接种后，相关类型的血清转化阳性率可达到近100%[58]。

MPL是TLR4激动剂[59]，所以AS04的直接作用仅限于表达TLR4的细胞(主要是人单核细胞和树突状细胞)，但不直接作用于B或T细胞。AS04在注射部位的直接免疫刺激作用是局部而短暂的，表现为局部细胞因子的释放[60]，与铝盐佐剂疫苗相比，AS04佐剂疫苗可减少抗原消耗，而且可以长时间产生保护性抗体。

4.3纳米铝佐剂 纳米铝佐剂是目前的热门研究课题。纳米铝佐剂具有较小的粒径、较大的比表面积、较强的吸附能力和佐剂活性，可以提高机体的免疫应答，并且有望降低佐剂的副作用[61]。常规铝佐剂在水溶液中形成1～20 μm的颗粒，而纳米颗粒的直径小于200 nm。颗粒疫苗佐剂通常在直径小于200 nm处达到最佳免疫效应[62]。此外，实验表明注射铝佐剂后某些抗原就会从一些铝佐剂中脱出，而包裹抗原的纳米铝佐剂可增加抗原结构的稳定性，不容易脱出[63]。

研究发现，纳米铝佐剂疫苗吸收迅速、产生抗体所需时间短，可明显提高抗体产生速度，诱导更强的免疫应答，炎症反应非常轻[64]。梁存军等[65]首次发现纳米氢氧化铝佐剂具有耐热性，在疫苗制备过程中可在121℃ 30 min的条件下灭菌，并且灭菌前后的佐剂性能保持不变，这使得纳米佐剂疫苗的安全性大大提高。然而，最近的研究表明，纳米材料在生物安全性和毒性方面可能存在一些问题[66]。纳米粒子的生物分布，毒性和免疫反应被证明与它们的纵横比有显著的联系[67,68]。 高纵横比纳米粒子如碳纳米管可激活NLRP3炎性体，它可以触发纤维化引起的肺毒性[69]。 纳米金属及其氧化物会导致肝脏和肾脏受损。小于200 nm的颗粒有可能穿过血脑屏障导致脑损伤[70]。因此，纳米铝佐剂的安全性和毒理性有待进一步研究，为其进一步发展奠定基础。新型纳米铝佐剂有望在不久的将来得到应用。

5 结语

铝佐剂在使疫苗成功免疫过程中起着重要作用，尽管铝盐佐剂能引起局部不良反应，铝盐仍比其他新佐剂更安全且更可靠，并且具有长期应用历史。就安全性而言，相对于其他的新型佐剂还是较为安全可靠的，在疫苗中加入铝佐剂的风险，当前看来还是很小的。目前非铝佐剂还无法完全取代铝佐剂，我们仍需进一步努力以寻求更好更安全的佐剂。近年来，国内外出现了许多新型人用疫苗佐剂。常规铝佐剂的磷酸化扩大了它们在疫苗中的应用范围。纳米铝佐剂的研究拓宽了铝佐剂在疫苗应用范围中的应用，具有广阔的应用前景，是未来研究的热点。