哌拉西林钠对CCl4诱导的大鼠急性肝损伤的保护作用及机制研究①

薛 冰 张家薇 段希斌

(郑州澍青医学高等专科学校，郑州450000)

肝脏是人体最大的解毒器官，也是最容易受损的器官之一[1]。缺血、病毒感染、免疫紊乱及外源性物质均可造成肝脏损伤[2]。肝病已经成为了一个世界性的健康问题。研究表明，药物滥用是导致肝病的主要原因之一，并且目前尚无具有明确肝保护及肝功能提高、肝细胞再生作用的药物用于临床[3]。因此，寻找治疗肝病的新的药物及方法仍是临床肝病治疗亟需解决的问题之一。研究表明，氧化自由基和活性氧诱导的氧化损伤及炎症反应可诱导肝细胞的功能紊乱及死亡，是导致肝脏损伤的主要原因[4,5]，提示有效抑制肝细胞氧化应激和炎症反应将有利于肝病的治疗。哌拉西林钠(Pipercillin sodium,PS)是临床常用的半合成青霉素类抗生素，具有抗炎、抗病毒、抗氧化等药理学活性。研究表明，PS常被用于治疗革兰氏阴性菌诱导的败血症[6]，还能减轻重症肺炎患者的临床症状，具有肺保护作用[7]。但其对肝损伤的作用及机制还未见报道。本研究采用CCl4诱导大鼠急性肝损伤，并同时给予PS，以探究PS对大鼠急性肝损伤的作用及机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂 40只健康SD雄性大鼠购自成都达硕实验动物有限公司，许可证号为SCXK(川)2013-24;PS购自北京双鹤药业，生产批号为120406;丙转氨酶(Alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(Alanine transaminase,ALT)试剂盒购自山东潍坊三维生物工程集团有限公司；白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、IL-1β和IL-10试剂盒购自南京生物工程研究所；肝组织超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)以及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)试剂盒购自上海碧云天生物技术公司；RIPA裂解液和封闭用山羊血清购自北京索莱宝生物科技公司；Bax(sc-65532)、Bcl-2(sc-56015)和Cleaved Caspase-3(sc-271028)一抗购自美国Santa Cruz公司，实验所用二抗购自英国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1动物分组及模型复制 将40只健康SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为对照组(Control，Ctrl)、PS组、四氯化碳(CCl4)组和CCl4+PS组。PS组和 CCl4+PS组大鼠每天腹腔注射给予PS，1 g/kg，连续给药7 d后，参照文献方法[3]，对CCl4组和CCl4+PS组大鼠腹腔注射CCl4溶液(1 ml/kg)。48 h 后处死大鼠，进行检测。

1.2.2样品准备 用10%水合氯醛麻醉大鼠，用注射器于心脏取血，静置1 h后3 500 r/min 4℃离心15 min，取上层血清储存于-20℃备用。同时，快速取下肝脏，并平均分为3份，取其中一份称重并用生理盐水洗净后剥离表面结缔组织，用组织匀浆机匀浆，15 000 r/min离心5 min，制作成10%的肝匀浆，随后用低温离心机3 000 r/min离心15 min，取上层上清液存储于-20℃保存备用。用4%多聚甲醛室温固定肝组织2 h，制作石蜡切片备用。

1.2.3HE染色 取肝组织石蜡切片，用二甲苯进行脱蜡处理后，用浓度梯度的酒精从高到低处理石蜡切片，随后用蒸馏水冲洗10 min后，将切片放入苏木精中染色15 min，用自来水冲洗15 min。随即采用2%盐酸乙醇溶液对切片进行分化和漂洗，用乙醇进行脱水后加入伊红乙醇液进行复染，最后再采用高浓度乙醇进行脱水，二甲苯透明并进行封片，于生物显微镜下观察记录。

1.2.4试剂盒及ELISA检测细胞因子活性 取冷冻的血清或肝组织匀浆上清液于4℃复融后，根据试剂盒说明书方法检测血清中ALT、AST、IL-6、IL-1β和IL-10的浓度，并检测肝组织匀浆上清液中SOD、GSH-Px及MDA的浓度。

1.2.5Western blot检测蛋白表达 取肝组织并用剪刀于冰上将肝组织剪碎成1 mm3大小的组织块，用RIPA裂解液提取各组大鼠肝组织总蛋白，用BCA试剂盒对蛋白质进行定量分析后，每组分别取等量蛋白质用10%SDS-PAGE分离蛋白并转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶对蛋白质进行封闭，室温封闭2 h，随后加入适宜浓度的一抗(Bcl-2,1∶1 000;Bax,1∶1 000)于4℃封闭过夜，第二天洗去未结合一抗，加入二抗室温孵育1 h。最后滴加化学发光显色液于暗室曝光显影。并用Image J对蛋白质条带灰度值进行统计分析。

1.2.6免疫组化检测Caspase-3表达 取石蜡切片并进行脱蜡处理后，用枸橼酸盐缓冲液对切片进行高压抗原修复，待切片在高压锅中冷却至室温后，用磷酸盐缓冲液清洗3次，加入5%的封闭用正常山羊血清室温孵育2 h。封闭完成后，滴加Caspase-3一抗，浓度为1∶200，并于4℃封闭过夜，第二天用磷酸盐缓冲液清洗切片3次，滴加生物素标记二抗，室温封闭2 h后，用苏木精复染，并滴加DAB显色液显色。于生物纤维镜下观察Caspase-3的表达情况。

2 结果

2.1PS对急性肝损伤大鼠肝功能的影响 HE染色结果表明，Ctrl组和PS组大鼠肝组织细胞排列整齐，并无明显的病理改变(图1)；CCl4组大鼠肝组织细胞排列紊乱，细胞核固缩，并伴有大量的炎性细胞浸润，表明CCl4能诱导大鼠肝组织损伤(图1)；CCl4+PS组大鼠肝组织细胞排列尚可，核固缩情况与CCl4组比较减轻，偶见少量的炎性细胞浸润(图1)，表明PS能改善CCl4诱导的大鼠肝损伤。同时，与Ctrl组比较，CCl4组大鼠血清ALT和AST浓度明显升高，PS组ALT和AST浓度无明显变化(P<0.05，图2)；与CCl4组比较，CCl4+PS组大鼠血清ALT和AST浓度显著降低(P<0.05，图2)，进一步表明PS具有肝保护作用。

2.2PS对急性肝损伤大鼠炎症反应的影响 与Ctrl组比较，PS组大鼠血清炎症因子IL-6、IL-1β和IL-10浓度无明显改变，CCl4组大鼠IL-6和IL-1β浓度明显升高，IL-10浓度明显降低(P<0.05，图3)；与CCl4比较，CCl4+PS组大鼠血清IL-6和IL-1β浓度显著降低，IL-10浓度显著升高(P<0.05，图3)，表明PS能抑制CCl4诱导的大鼠肝组织炎症反应。

2.3PS对急性肝损伤大鼠氧化应激的影响 实验结果表明，CCl4组大鼠肝组织SOD和GSH浓度明显低于Ctrl组，MDA浓度明显高于Ctrl组(P<0.05，图4)；CCl4+PS组大鼠肝组织SOD和GSH浓度与CCl4组比较明显升高，MDA浓度与CCl4比较显著降低(P<0.05，图4)，表明PS能抑制CCl4诱导的肝组织氧化应激。

2.4PS对急性肝损伤大鼠细胞凋亡的影响 与Ctrl组比较，PS组细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达水平无明显变化，CCl4组大鼠肝组织Bcl-2表达水平明显降低，Bax表达水平明显升高(P<0.01，图5)，Bcl-2/Bax的比值明显降低(P<0.001，图6)；与CCl4组比较，CCl4+PS组Bcl-2表达水平明显升高，Bax表达水平明显降低(P<0.01，图5)，Bcl-2/Bax的比值明显升高(P<0.001，图6)，表明PS能抑制CCl4诱导的肝细胞凋亡。此外，免疫组化实验结果表明，CCl4能显著升高肝组织Cleaved Caspase-3的表达水平，PS能显著减弱CCl4对Cleaved Caspase-3表达的促进作用(P<0.05，图7)，进一步表明PS能抑制CCl4诱导的肝细胞凋亡。

图1 PS对大鼠肝组织损伤的作用(×100)Fig.1 Effects of PS on acute liver injury of rats(×100)Note: The HE staining was performed for liver injury.

图2 PS对急性肝损伤大鼠血清ALT和AST浓度的影响Fig.2 Effects of PS on concentrations of ALT and AST of acute liver injury ratsNote: *.P<0.05 vs Ctrl group;#.P<0.01 vs CCl4 group.

图3 PS对IL-6、IL-1β和IL-10浓度的影响Fig.3 Effects of PS on concentrations of IL-6,IL-1β and IL-10Note: The concentrations of IL-6,IL-1β and IL-10 were determined by ELISA assay.*.P<0.05 vs Ctrl group;#.P<0.01 vs CCl4 group.

图4 PS对肝组织SOD、MDA和GSH浓度的影响Fig.4 Effects of PS on levels of SOD,MDA and GSHNote: The levels of SOD,MDA and GSH was measured by kits.*.P<0.05 vs Ctrl group;#.P<0.01 vs CCl4 group.

图5 PS对Bcl-2和Bax表达的影响Fig.5 Effects of PS on expressions of Bcl-2 and BaxNote: The protein levels of Bcl-2 and Bax were measured by Western blot.GAPDH was used as loading control.* *.P<0.01 vs Ctrl group;##.P<0.01 vs CCl4 group.

图6 PS对Bcl-2/Bax比值的影响Fig.6 Effects of PS on ratio of Bcl-2/BaxNote: * * *.P<0.01 vs Ctrl group;###.P<0.01 vs CCl4 group.

3 讨论

CCl4诱导动物肝损伤是最常见的肝损伤动物模型的造模方法，因为其发病机制与人类肝病的发病机制类似而被广泛应用[8,9]。CCl4诱导肝组织损伤机制包括自由基的产生、细胞膜脂质过氧化及脂质过氧化诱导的炎症反应[10]。CCl4进入体内首先能被肝脏代谢为高活性的三氯甲基自由基，直接诱导肝组织的损伤，同时三氯甲基自由基还可转化为三氯甲基过氧化自由基，进一步启动脂质过氧化[11,12]。大量氧化自由基的存在可加速细胞膜过氧化降解，导致肝细胞细胞膜的破坏，使ALT和AST渗漏到细胞外，从而进入血液循环，导致小叶中心细胞坏死、气球样变性和细胞浸润[3,13]。因此，在本研究中我们首先采用HE染色判断CCl4处理后大鼠肝组织的病理损伤情况，并检测血清ALT和AST活性。实验结果表明，CCl4组大鼠肝组织细胞排列紊乱、细胞核固缩并有大量炎性细胞浸润，表明CCl4可导致大鼠肝损伤。PS对正常大鼠肝组织无明显影响，但能减轻CCl4诱导的急性肝损伤模型大鼠的肝损伤情况，提示可能对化学物质引起的肝损伤具有保护作用。此外，PS还能显著降低急性肝损伤模型大鼠血清ALT和AST的浓度，进一步表明PS具有肝保护作用。

氧化应激是CCl4诱导肝损伤的主要机制。在肝脏中，CCl4可被细胞色素P450转化为三氯化碳自由基，进而诱导肝实质细胞坏死，导致肝功能受损[14]。抑制肝组织氧化应激能减轻CCl4诱导的肝损伤[15]。研究发现，PS具有抗氧化应激的作用[6]。本研究通过检测氧化应激相关指标发现，CCl4能显著升高大鼠血清脂质过氧化产物MDA的浓度，并降低过氧化物酶SOD和GSH的浓度，PS能显著减弱CCl4对MDA的诱导作用及对SOD和GSH的抑制作用。研究表明，SOD和GSH在对抗CCl4诱导的肝损伤中发挥着重要作用[16]。过氧化物酶和还原性谷胱甘肽是重要的抗氧化酶，能够减少组织过氧化物和氧化自由基的产生[17]。MDA是脂质过氧化的重要中间产物，与脂质过氧化程度呈正相关。结合实验结果表明，PS能抑制CCl4诱导的肝组织氧化应激，从而发挥肝保护作用。

研究表明，过度氧化应激还可诱导肝组织炎症反应[10]。过量的活性氧可激活炎症反应相关通路从而诱导炎症因子的释放[18]。同时，CCl4也能直接诱导炎症因子的产生，并诱导细胞外基制的沉积，加速肝纤维化甚至诱导肝癌的发生[19]。斛皮黄酮抑制小鼠肝组织炎症反应能显著减轻CCl4诱导的急性肝损伤[20]。蝴蝶素A也能通过抑制炎症反应促进CCl4诱导的急性肝损伤小鼠肝脏结构及功能的恢复[10]。本文研究发现，PS能显著降低急性肝损伤模型大鼠血清炎症因子IL-6和IL-1β的浓度，并升高IL-10的浓度，IL-10是一类重要的抑炎因子，表明PS能抑制急性肝损伤大鼠肝组织炎症反应。

细胞凋亡是导致肝功能损伤的重要机制。氧化应激可诱导肝细胞的死亡，过量的活性氧可直接作用于线粒体诱导Caspase凋亡信号通路的启动，诱导细胞DNA降解和细胞凋亡[21]。Bcl-2家族蛋白Bcl-2和Bax是线粒体诱导细胞凋亡的重要调控蛋白。研究表明，Bax在CCl4诱导的急性肝损伤过程中表达增多，可抑制Bcl-2的表达从而促进线粒体细胞色素C的释放，诱导Caspase-3表达，促进DNA降解，导致细胞凋亡[22]。本文研究结果表明，CCl4能显著降低大鼠肝组织Bcl-2的蛋白表达水平，促进Bax及Caspase-3的表达，表明CCl4能诱导肝细胞凋亡。PS能显著升高急性肝损伤大鼠肝组织Bcl-2的表达水平，抑制Bax和Caspase-3的表达，表明PS能抑制CCl4诱导的线粒体细胞凋亡。

综上所述，PS能减轻CCl4诱导的肝损伤，降低肝组织ALT和AST的浓度；同时还能降低肝组织MDA活性，促进SOD和GSH的分泌，抑制促炎症因子IL-6和IL-1β的活性，升高血清抑炎因子IL-10浓度。此外，PS还能促进急性肝损伤大鼠肝组织Bcl-2的表达，抑制凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3的表达，提示PS能通过增强肝脏功能、抑制细胞凋亡对抗CCl4诱导的大鼠急性肝损伤，作用机制与抑制肝组织氧化应激和炎症反应有关。

本研究首次探究了PS对急性肝损伤的作用，并发现PS具有潜在的肝保护活性，可能为PS与其他药物联合用药从而降低药物的肝毒性作用提供实验数据。