紫杉醇对人鼻咽癌低分化鳞癌HNE1细胞系增殖和凋亡的影响

黄婉兰

[摘要]目的 探讨紫杉醇（TAX）对人鼻咽癌低分化鳞癌HNE1细胞系增殖和凋亡的影响。方法 采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测不同浓度TAX对HNE1细胞的增殖抑制情况，TAX 0、2.5、5、10、20、40、80 nmol/L对HNE1细胞分别作用12、24、36、48、72 h，以TAX 0 nmol/L作为对照组，采用流式细胞术和原位末端标记法（TUNEL）检测不同浓度TAX对HNE1细胞凋亡的影响。结果 72 h最高增殖抑制率超过70%，不同浓度TAX（2.5、5、10、20、40、80 nmol/L）对HNE1细胞的增殖抑制率与作用时间呈时效关系（P<0.05），但与药物浓度未呈量效关系（P>0.05）;流式细胞术检测细胞凋亡情况显示，TAX 0、5、10、20 nmol/L作用HNE1细胞48 h的早期及中晚期凋亡率比较，差异均有统计学意义（P<0.05），呈浓度依赖关系。TUNEL检测细胞凋亡情况显示，TAX 0、5、10、20 nmol/L作用HNE1细胞48 h后的凋亡指数比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 TAX能够抑制人鼻咽癌低分化鳞癌HNE1细胞系的增殖，诱导细胞凋亡。

[关键词]紫杉醇;HNE1细胞;增殖;凋亡

[中图分类号] R739.63     [文献标识码] A     [文章编号] 1674-4721（2019）11（b）-0085-03

Effect of Paclitaxel on proliferation and apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma with poorly differentiated squamous cell carcinoma HNE1 cell line

HUANG Wan-lan

Department of Chemotherapy， Jieyang People′s Hospital， Guangdong Province， Jieyang   522000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Paclitaxel （TAX） on proliferation and apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma with poorly differentiated squamous cell carcinoma HNE1 cell line. Methods Methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） method was used to detect the inhibitory effect of tax on the proliferation of HNE1 cells. TAX 0， 2.5， 5， 10， 20， 40 and 80 nmol/L to HNE1 cells for 12， 24， 36， 48 and 72 h， respectively. TAX of 0 nmol/L was used as the control group. The effect of different concentrations of TAX on the apoptosis of HNE1 cells were detected by flow cytometry and in situ end labeling （TUNEL）. Results The highest proliferation inhibition rate was over 70% at 72 h. The inhibitory rate of TAX （2.5， 5， 10， 20， 40， 80 nmol/L） on the proliferation of HNE1 cells was time-dependent （P<0.05）， but not dose-dependent （P>0.05）. The results of flow cytometry showed that the early and middle late apoptosis rate of HNE1 cells treated with TAX 0， 5， 10， 20 nmol/L for 48 hours was statistically significant （P<0.05）， with concentration dependent. TUNEL showed that the apoptosis indexes of HNE1 cells under TAX 0， 5， 10， 20 nmol/L for 48 hours were significantly different （P<0.05）. Conclusion TAX can inhibit the proliferation of human nasopharyngeal carcinoma poorly differentiated squamous cell carcinoma HNE1 cell line and induce apoptosis.

[Key words] Paclitaxel; HNE1 cells; Proliferation; Apoptosis

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma）為中国南方常见的恶性肿瘤，发病率为（10～30）/10万[1]。放疗或联合化放疗仍是鼻咽癌的主要治疗手段，局部复发及远处转移是治疗失败的主要原因[2]。紫杉醇（Paclitaxel，TAX）为复发转移鼻咽癌的常用治疗药物，能够提高疾病缓解率和局部控制率，但未能提高总生存率[3-6];合适的应用方法仍未确定。本研究旨在探讨TAX对鼻咽癌细胞系的抗增殖及诱导凋亡的作用，为临床合理应用提供理论依据，现报道如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1药物与试剂  TAX购于百时美施贵宝公司，DMEM培养基购于GIBCO公司，胰酶购于Sigma公司，新牛血清购于杭州四季青公司，Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒购于南京凯基公司，TUNEL试剂盒购于德国Roche公司，DAB试剂盒购于福州迈新生物技术开发公司，分析纯二甲基亚砜（DMSO）及四甲基偶氮唑蓝（MTT）购于美国AMRESCO公司。

1.1.2细胞培养  人鼻咽癌细胞株HNE1由中南大学肿瘤研究所提供，细胞培养用含15%新生牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的DMEM培养基，于37℃、95%湿度、5% CO2条件下进行培养。各组细胞设3个平行组，实验均重复3次。

1.2方法

1.2.1 MTT法检测不同浓度TAX对HNE1的增殖抑制作用  取对数生长期HNE1细胞，按2×103/孔種植于96孔板，贴壁培养24 h，TAX 0、2.5、5、10、20、40、80 nmol/L 分别作用HNE1细胞12、24、36、48、72 h后（以TAX 0 nmol/L作为对照组，其余为实验组），每孔加入浓度为5 g/L的MTT 20 μl，37°C继续孵育4 h，弃MTT液，加入150 μl DMSO，待MTT结晶充分溶解后，应用酶标光度仪测定各孔492 nm的A值，计算各实验组对HNE1细胞的增殖抑制率。增殖抑制率=（1-实验组A值）/对照组A值×100%。

1.2.2流式细胞术检测不同浓度TAX诱导NHE1细胞的凋亡发生情况  取对数生长期HNE1细胞4瓶，按TAX 0、5、10、20 nmol/L作用NHE1细胞48 h后，0.25%胰蛋白酶常规消化， PBS洗涤细胞2次（离心2000 r/min，5 min），收集1×105个细胞，500 μl Binding buffer悬浮细胞，加入10 μl Annexin V-FITC混匀后加入5 μl Propidium Iodide，室温避光5 min，用FACSCalibur CV<2流式细胞仪检测对照组、TAX 5、10、20 nmol/L作用NHE1细胞48 h后HNE1细胞的凋亡发生情况。

1.2.3原位末端标记法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）检测不同浓度TAX诱导NHE1细胞的凋亡情况  实验处理及细胞悬液处理同方法“1.2.2”。细胞悬液离心成团制成石蜡团块，4 μm厚连续切片。按照德国Roche公司TUNEL试剂盒说明书步骤进行。显微镜下（400×）计数上下左右中5个不同视野的凋亡细胞数及总细胞数，计算凋亡指数。凋亡指数=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.3统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组样本均数比较采用单因素方差分析，均数间相差的显著性比较采用方差分析中的Student-Newman-Keult Q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1不同浓度TAX对HNE1细胞12、24、36、48、72 h增殖抑制率的比较

不同浓度TAX（2.5、5、10、20、40、80 nmol/L）对HNE1细胞的增殖抑制率与作用时间呈时效关系（P<0.05），但与药物浓度未呈量效关系（P>0.05）（表1）。

2.2不同浓度TAX作用HNE1细胞48 h的早期及中晚期凋亡率的比较

流式细胞术检测细胞凋亡情况显示，TAX 0、5、10、20 nmol/L作用HNE1细胞48 h的早期及中晚期凋亡率比较，差异均有统计学意义（P<0.05），呈浓度依赖关系（表2）。

2.3 TUNEL法检测HNE1细胞的凋亡情况

经TUNEL法染色后阳性物质呈棕褐色颗粒，位于细胞核内。凋亡细胞多呈圆形，少数形状不规则。TAX 0、5、10、20 nmol/L作用HNE1细胞48 h后的凋亡指数分别为（2.33±0.58）、（8.33±1.53）、（9.25±2.06）、（18.25±1.26）%，不同浓度之间比较，差异有统计学意义（P<0.05），呈浓度依赖关系。

3讨论

鼻咽癌是指发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤，是我国高发恶性肿瘤之一，发病率为头颈部恶性肿瘤之首。其发病因素较为多样，包括遗传因素、病毒感染、环境因素等，发病后患者多伴有鼻塞、涕中带血、耳闷堵感、听力下降等临床症状，严重影响患者的身体健康。目前学界关于其发生机制尚未统一阐明，临床多认为与以下3个因素存在一定关系：①遗传因素。临床发现多数鼻咽癌患者存在家族疾病史，具有垂直和水平的家族发生倾向。在我国，该病多发于广东、广西、湖南、福建和江西南方5省，具有明显的地域集中性。②病毒感染。从鼻咽癌组织中分离出了带病毒的类淋巴母细胞株，少数在电镜下可见病毒颗粒。③环境因素。移居国外的国人，鼻咽癌死亡率随着遗传代数增加而逐步下降，而出生于东南亚的白种人，鼻咽癌发病率也有所提升，提示环境因素在鼻咽癌发病中起着重要的作用。药物治疗是鼻咽癌治疗的常用手段，TAX是近年来研究开发的化学结构新颖、作用机制独特的新型抗肿瘤药物，能够促进微血管双聚体装配成微管，进而阻断微管蛋白解聚而使微管处于稳定状态，从而抑制细胞分裂，起到诱导癌细胞凋亡及生长的作用。查阅知网、万方、维普等数据库，发现学界关于TAX治疗鼻咽癌的报道研究近年来逐步增多，但更多是分析TAX对癌细胞的作用，关于其浓度差异对鼻咽癌HNE1细胞增殖、凋亡的影响少有提及。鉴于此，本研究以此为着眼点展开对比研究，结果显示，不同浓度TAX对鼻咽癌HNE1细胞均有增殖抑制和诱导凋亡作用，增殖抑制呈时间依赖性，而不存在此浓度范围的依赖性，然而诱导细胞凋亡则呈浓度依赖关系（P<0.05）。

TAX通过与β微管蛋白结合，促进微管蛋白组装和稳定微管，阻止微管解聚，干扰细胞有丝分裂进程，发挥其抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡作用[7-8]。本研究结果提示，不同浓度TAX对鼻咽癌HNE1细胞均有增殖抑制和凋亡诱导作用，这与文献报结果一致[9-11];其抗鼻咽癌作用也已有临床研究证实[12]。但本研究抗增殖作用未存在剂量依赖性，与文献报告存在一定的差异，估计与研究所设定的剂量浓度范围差异有关;王承龙等[13]对鼻咽癌CNE1研究也提示TAX仅在一定剂量范围内有剂量依赖性，但同一剂量有明显的时间依赖性，提示一定浓度内，TAX的抗肿瘤作用仅呈时效性，分次给药可能优于单次给药，并己得到相关临床研究证实。ECOG1199研究[14]发现在早期乳腺癌术后辅助治疗中，TAX每周给药明显优于三周方案;Satpute等[15]的研究也提示TAX每周方案能够提高乳腺癌的病理完全缓解率，同样在晚期卵巢癌研究中也發现TAX剂量每周给药明显优于三周方案，但毒副作用也增加。

综上所述，TAX对人鼻咽癌HNE1细胞系有增殖抑制、诱导凋亡的作用，其增殖抑制作用可能为诱导细胞凋亡，但其具体机制仍需进一步实验探索。

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（收稿日期：2018-11-22  本文编辑：闫  佩）