灰树花液体发酵及多糖提取优化研究

季宏更 郑惠华 全卫丰* 蒋 益 刘广建 薛 璟 汪 洁

（1江苏省苏微微生物研究有限公司，江苏无锡214063；2江苏省（苏微）菌物工程技术研究中心，江苏无锡214063；3江苏安惠生物科技有限公司，江苏南通216009）

灰树花属于担子菌亚门，层菌纲，无隔担子菌亚纲，非褶菌目，多孔菌科，树花属中的一种大型真菌[1]，又名贝叶多孔菌，舞茸。灰树花多糖是灰树花的主要功能性成分之一，具有调节免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等作用[2]，有着重要的市场开发价值。Ohno等采取液体深层培养的方法生产灰树花多糖，并对其进行分离及成分研究，证明其与天然来源的灰树花多糖具有相似的单糖组成和结构[3，4]，灰树花多糖根据来源的不同又可分为胞内多糖和胞外多糖，二者均具有类似的生物活性，国内外的研究实践表明液体发酵法生产提取制备灰树花多糖是实现其工业化生产的重要途径和方法。目前真菌多糖的提取方法有水提醇沉法、酸碱提取法等，水提醇沉法具有对环境友好、提取工艺简单等优点，是目前应用较多的方法，但其提取效率有待于进一步提高。近年来也出现了利用超声辅助、微波辅助、蒸汽爆破法以及酶法等进行真菌多糖的辅助提取，取得了一定的效果，均是通过一定的方法破坏细胞和细胞壁，促进目标物的溶出。超声提取利用超声产生的“空穴作用”破坏细胞壁和细胞膜结构，增加了细胞内溶物的穿透能力；微波提取法是通过微波传递能量到细胞，使细胞内压力增大，细胞壁破裂从而形成微孔，加速细胞内容物的溶出；而蒸汽爆破法是利用蒸汽受压缩而后突然减压时释放出的强大力量冲破物料细胞壁，撕裂组织，从而提高物质的提取效率。笔者对灰树花液体发酵工艺进行了研究和优化，旨在提高灰树花多糖的产率；同时综合比较了多种不同的辅助提取方法对于灰树花多糖提取的效果，以期在传统提取方法的基础上优选出一种更为理想的多糖提取工艺，提升灰树花粗多糖的提取效率。

1 材料与方法

1.1 试验材料

①供试菌株：灰树花菌株，编号AHSWF-001，为自有诱变菌株。②仪器与设备：旋转式摇床（HZ-81），100 L发酵罐及配套装备，循环水式多用真空泵SHB-ⅢA，紫外可见分光光度计（Alpha-1500），SG2pH计（梅特勒托利多），超声波清洗仪K45200DE，微波仪（KJ25B-A），高压蒸汽爆破仪（自制）。③培养基：PDA培养基为葡萄糖2%，马铃薯（去皮煮沸过滤取汁）2%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，琼脂2%，水1000 mL，pH自然。种子液培养基为豆饼粉1.5%，玉米粉1.5%，葡萄糖2%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，VB10.001%，加水1000 mL，pH自然。

1.2 试验方法

1.2.1 灰树花液体发酵培养基的优化

1.2.1.1 单因素试验

试验确定适宜的碳源和氮源。

基础培养基：蛋白胨1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，VB10.001%，加水1000 mL，pH自然。

碳源的优选：在基础培养基中添加2%质量比的供试碳源（蔗糖、玉米粉、葡萄糖和可溶性淀粉），考察添加不同的碳源对灰树花液体发酵菌丝生物产量的影响；

氮源的优选：在基础培养基中添加1%质量的供试氮源（豆饼粉，麸皮，蛋白胨，酵母膏，尿素）（豆饼粉、玉米粉过80目筛，99℃浸提1 h，麸皮99℃浸提1 h），考察添加不同的氮源对灰树花液体发酵菌丝生物产量的影响。

上述试验每个处理作三个平行。液体种制作：PDA斜面菌种活化后，接种于种子液中，140 r/min，26℃培养10 d（下同）。发酵条件：灰树花种子液按5%接种量接入含不同碳、氮源试验培养基中，26℃，140 r/min旋转式摇床培养6 d，抽滤，65℃烘干，称量菌丝体干重即为菌丝体生物量。

1.2.1.2 正交试验设计

以单因素试验中最适碳源、氮源以及葡萄糖和接种量为四因素，按L9（34）设计4因素、3水平正交试验进行复选，与基础培养基组成9个配方，见表2。

1.2.1.3 100 L发酵罐中试试验

按优化后的配方配制培养基，装液量60 L，以10%接种量接种种子液，搅拌速度140 r/min，通气比1∶0.5（体积比），培养约120 h后，以还原糖不再下降、pH出现回升时终止发酵，放罐。测定菌丝体生物量和多糖总产率。

1.2.2 灰树花多糖的提取

菌丝体粗多糖提取试验流程：菌丝体烘干粉碎筛→加水→辅助提取→水浴提取→过滤→滤液浓缩→醇沉→干燥→提取物

发酵液粗多糖提取流程：发酵液→浓缩→醇沉→干燥→提取物

水提法提取多糖的试验：样品为烘干后的灰树花菌丝体，粉碎过80目筛，以料水比、提取时间、提取温度为不同的因素。因素水平设置如下：料水比为1∶10，1∶20，1∶30；提取时间为0.5 h，1 h，1.5 h；提取温度为80℃，90℃，100℃。按照不同的处理提取多糖，提取液抽滤，浓缩至约1/10体积，4倍体积无水乙醇4℃醇沉，沉淀干燥，得提取物。测定样品中的粗多糖含量。

辅助法提取多糖的试验：以不同的辅助方法对样品进行处理，然后以水提法进行粗多糖的提取。比较不同的辅助方法所对应多糖提取率，同时每个方法中选取不同的因素水平，每个水平作三个平行试验，考察在上述试验中不同的因素水平处理对多糖提取结果的影响。

超声辅助提取：样品烘干粉碎后，45℃超声提取10 min，20 min，30 min。料水比设置1∶10，1∶20，1∶30，而后100℃沸水浴提取1 h，合并滤液浓缩至1/10体积，加入4倍体积无水乙醇沉淀，4℃静置，3000 r/min离心15 min，取沉淀干燥，得提取物。计算样品中的粗多糖含量。试验基准条件为料水比1∶20，超声提取20 min。

微波辅助提取：样品烘干粉碎，加水，料水比1∶20，850 W，微波加热 5 min，10 min，15 min，然后按上述水提法进行粗多糖的提取，测定样品中粗多糖含量。

爆破提取法：样品烘干粉碎，加水，料液比1∶20，通蒸汽升压，压力设置为 0.8 MPa，1.2 MPa，1.6 MPa，维压时间选择5 min，10 min，15 min。迅速放压后得爆破渣和爆破液，混合后以水提法进行粗多糖的提取，得提取物。测定样品中的粗多糖含量。试验基准条件为压力1.2 MPa，维压时间20 min。

1.2.3 计算方法

菌丝生物量（g/100 mL）：液体发酵后混合液抽滤，取菌丝体105℃烘干至恒重，称重。

粗多糖的提取率（%）：采用一定的提取方法进行多糖提取后测算出样品中粗多糖的含量，试验中粗多糖的含量测定均采用硫酸蒽酮法[5]。

粗多糖提取收率（%）=提取物中的多糖质量/样品中多糖质量×100

粗多糖的总产率（g/L）=菌丝体生物量（g/L）×菌丝体中粗多糖的含量（%）+发酵液中粗多糖的含量（g/L）

2 结果与分析

2.1 摇瓶液体发酵试验结果

2.1.1 单因素试验结果

由表1可见，在基础培养基中添加2%玉米粉为碳源，摇瓶液体发酵后灰树花菌丝体生物量同比最高，在基础培养基中添加1%豆饼粉为氮源时，摇瓶液体发酵菌丝体生物量同比最高，因此选择玉米粉和豆饼粉作为优选后的液体发酵培养基中的碳源和氮源。

表1 不同碳氮源对灰树花液体发酵菌丝体生物量的影响

2.1.2 液体发酵正交试验结果

葡萄糖作为可快速利用的速效碳源，对菌丝体前期的生长具有重要作用，接种量直接影响液体发酵的时间和生物量，因此选择豆饼粉、玉米粉、葡萄糖的添加量和接种量的作为正交试验的四因素，以四因素三水平进行如下正交试验设计。

表2 正交试验因素及水平

由表3可见，对试验中液体发酵菌丝体生物量影响最大的因素为C接种量（对应的R值最高），由表3中K值显示试验最佳组合A1B3C3D2，即豆饼粉0.75%，玉米粉2.5%，葡萄糖2.5%，接种量10%。因此，摇瓶液体发酵试验中筛选到的最佳培养基配方及发酵条件为，豆饼粉0.75%，玉米粉2.5%，葡萄糖2.5%，蛋白胨1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，VB10.001%，水 1000 mL，pH 自然。发酵条件：26℃，140 r/min摇床培养10 d。经过验证试验，灰树花摇瓶液体发酵生物量为1.210 g/100 mL，此时菌丝体多糖的产率达到0.78 g/L。

2.2 灰树花粗多糖的提取结果

水提法多糖提取试验结果见表4。

采用单因素试验方法。由表4可见，水提法提取多糖适宜的料水比为1∶20，此时对应的粗多糖提取率最高，为4.46%；在提取时间0.5～1.5 h，粗多糖提取率总体随提取时间的增长而增长，呈现先增长迅速，而后增长缓慢的趋势，适宜的提取时间为1.5 h；粗多糖提取率随提取温度的升高呈上升趋势，在100℃时相应的粗多糖含量最高。因此，试验确定的适宜的提取参数为料水比1∶20，提取时间1.5 h，100℃提取。

表3 正交试验数据

由表5可见，超声、微波和爆破辅助提取法对于提高灰树花多糖提取率均有一定的促进作用，其中超声辅助提取的效果最好，其次为爆破辅助提取法。在超声辅助提取时，提取时间选择30 min左右效果较好，此时粗多糖提取率达到4.81%，爆破辅助提取时压力选择为1.5 MPa，维压时间30 min效果较好，微波加热时间选择在15 min时效果较好。超声辅助提取30 min时粗多糖提取率比对照CK（单一水提法）提高了9.32%。

表4 水提法提取灰树花多糖试验结果

表5 多种辅助方法多糖提取的比较试验

3 小结与讨论

以100 L发酵罐进行灰树花液体发酵中试验结果显示，采用试验优选出的培养基配方：豆饼粉0.75%，玉米粉2.5%，葡萄糖2.5%，蛋白胨1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，VB10.001%，水1000 mL，pH自然。接种量10%，搅拌速度140 r/min，26℃，培养120 h，灰树花菌丝体干重达到21.97 g/L，灰树花总多糖的产率达到3.29 g/L。

在灰树花液体发酵生产过程中，灰树花多糖的产率及质量受菌种、培养基、发酵条件和工艺的影响较大，后续需要继续进行放大试验和多糖产品分离纯化、结构功效的研究，以期实现产业化生产。

试验结果表明超声辅助水提法，适合应用于灰树花多糖的提取，效果较好。具体工艺和参数为：菌丝体粉碎后过80目筛，加水，料水比1∶20，45℃超声提取30 min，而后100℃提取1.5 h，提取液过滤，浓缩至1/10体积，4倍体积无水乙醇沉淀，干燥得提取物。经测定灰树花多糖的提取率达到85%，提取物的多糖纯度为65%，蛋白肽的含量为30%左右，因蛋白肽具有较高的药理保健作用，在试验中未进行蛋白肽的去除。

近年来有不同研究者先后利用微波法、酶法、蒸汽爆破法等方法进行真菌多糖的辅助提取，各种方法各有优势，对多糖的提取均起到了一定的促进作用。多糖提取工艺的设计优化，要综合考量平衡提取效率、生产能耗成本、工艺设备简便及可操作性等因素，以提高提取技术方法的市场竞争力，为实现产业化生产创造条件。超声辅助灰树花多糖提取工艺具有提取效率较高、设备较为简便、提取时间较短以及能耗较低等优点，该技术适合进行推广应用。