正五聚蛋白3在儿童过敏性紫癜中的临床意义

刘鑫， 杨达胜

过敏性紫癜(Henoch-Schönlein purpura，HSP)是一种常见的系统性小血管炎症性疾病，其病理特点是IgA介导的全身小血管炎症性损伤，HSP累及肾脏造成肾脏损伤被称为紫癜性肾炎(Henoch-Schönlein purpura nephritis，HSPN)。肾累及是影响HSP儿童长期预后的关键因素。确诊HSP肾损伤最可靠的证据是肾活检，但因小儿肾活检具有侵袭性，可能导致泌尿系统出血性损伤，风险较大，多数患儿及其家属难以接受。现临床上应用的肾损伤指标如血浆肌酐、血浆尿素氮、尿量、胱抑素C及β2-微球蛋白都在一定程度上存在一些局限性，影响预测早期肾损伤的发生，所以仍需寻找、研究新的生物标记物来更好的对肾损伤的早期做出预测，从而早发现、早治疗，达到良好的预后。

正五聚蛋白是一种多功能的保守蛋白，五聚素3属于长链正五聚蛋白，除炎性细胞因子外，Toll样受体激动剂，如脂多糖、外膜蛋白A和完整的微生物，都能快速诱导多种细胞类型的五聚素3表达，包括髓样树突状细胞、肾上皮细胞、系膜细胞和颗粒细胞等。有研究表明，在IgA肾病患者的肾活检中，在扩张的系膜区域的肾小球系膜和内皮细胞中观察到五聚素3的强烈染色。与这些发现相反，肾小球肾病患者的正常肾组织和活检对五聚素3表达主要为阴性[1]。在IgA肾病中，五聚素3通过诱导继发性介质(例如血小板激活因子)的产生，参与到血管内皮细胞和内皮细胞的活化中，这一机制可能导致肾小球和肾小管间质损伤。在肿瘤坏死因子α和IgA刺激下，体外培养的人肾小球系膜细胞合成五聚素3，并表现出重组五聚素3的特异性结合[2]。五聚素3诱导的系膜细胞的细胞形态(细胞收缩)的形态学改变与肾小球滤过面积和滤过系数的减少有关。由于五聚素3与IgA肾病的发生和发展有关，所以推测五聚素3也有可能与HSPN存在或多或少的相关性，然而关于五聚素3在HSPN中的研究很少。本研究通过对50例HSP患儿及20例正常儿童检测其血浆及尿液中五聚素3的表达水平，探讨其在HSP中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年3月至2017年9月新乡医学院第一附属医院儿科收治的HSP患儿50例，根据有无累及肾脏分为HSP组32例和HSPN组18例。HSP组中男18例，女14例；年龄4～12岁，平均年龄(7.09±2.70)岁。HSPN组中男8例，女10例；年龄3～10岁，平均年龄(6.89±2.21)岁。同期选取门诊健康体检的20例正常儿童作为对照组，其中男9例，女11例；年龄4～10岁，平均年龄(7.25±1.91)岁。3组研究对象在性别、年龄方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 诊断标准 参照2013年中华医学会儿科学分会免疫学组制定的《儿童过敏性紫癜循证诊治建议》中的HSP的诊断标准[3]。参照2016年由中华医学会儿科分会肾脏病学组制定的《紫癜性肾炎诊治循证指南》中HSPN的诊断标准[4]。

1.3 纳入标准 (1)符合HSP和HSPN的诊断标准；(2)年龄3～12岁；(3)本研究经医院伦理委员会审核批准(批准编号：2016090)，患儿家属知情同意。

1.4 排除标准 (1)IgA肾病；(2)血小板减少性紫癜；(3)系统性红斑狼疮、冷球蛋白血症等继发性小血管炎；(4)肝炎、结核等造成的血尿和(或)蛋白尿；(5)合并感染的HSP；(6)随访6个月，血尿/蛋白尿持续不转阴的HSP；(7)临床资料不全者。

1.5 研究方法

1.5.1 标本的采集及处理 所有受试者入院次日或体检当日清晨取外周静脉血2 mL及晨起清洁中段尿液，待受试者达到恢复期时再次采集受试者空腹时静脉血2 mL及清晨清洁中段尿液，静脉血样本应用乙二胺四乙酸抗凝管收集，尿液样本应用无菌管收集，所有样本均在离心机以2 000 r/min离心20 min，收集上清，并储存于-80 ℃冰箱冻存以待检验。血浆及尿液五聚素3浓度测定均采用酶联免疫吸附剂测定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，实验室流程及具体试验方法均按照试剂盒说明书进行。

1.5.2 结果计算 以标准物的浓度为纵坐标，OD值为横坐标，计算出标准曲线的多项式二次回归方程，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

1.6 观察指标 各组血浆和尿液中五聚素3表达水平；HSP组和HSPN组患儿急性期、恢复期血浆、尿液五聚素3表达水平。

2 结果

2.1 各组血浆和尿液中五聚素3表达水平比较 见表1。

表1 各组血浆、尿液中五聚素3表达水平比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与HSP组比较，bP<0.05。

表1结果表明，HSP组和HSPN组血浆和尿液中五聚素3的表达水平显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；HSPN组血浆和尿液中五聚素3的表达水平显著高于HSP组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 HSP组和HSPN组患儿急性期、恢复期血浆、尿液五聚素3表达水平比较 见表2。

表2 HSP组和HSPN组患儿急性期、恢复期血浆、尿液五聚素3表达水平比较

注：与急性期比较，at=3.708，3.327，12.546，9.364，P<0.05。

表2结果表明，HSP组和HSPN组恢复期血浆和尿液中五聚素3的表达水平显著低于急性期，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

HSP是儿科常见的全身性免疫性小血管炎症性疾病，其致病因素众多，其中感染因素(如细菌、病毒、支原体、寄生虫等)最为常见，其次食物及药物因素、遗传因素及疫苗接种因素等。本病发病机制尚未完全阐明，但一般认为主要涉及遗传学背景及感染或过敏后机体免疫紊乱(IgA、补体系统相关体液免疫紊乱、T淋巴细胞异常相关的细胞免疫等)[5-6]、炎性细胞和炎性细胞因子的作用、凝血和纤溶机制的参与等几个方面。影响HSP儿童长期预后的关键因素在于有无存在肾脏损害，在疾病早期发现肾脏损害，并予以相应的治疗对HSP患儿的预后有很大的干预作用，现阶段的肾损伤标志(血浆肌酐、血浆尿素氮、尿量、胱抑素C及β2-微球蛋白等)都有一定程度的局限性，因此寻找、研究新的生物标记物来更好的对肾损伤的早期做出预测至关重要。

正五聚蛋白是一种具体多种生物活性功能的保守蛋白。主要依据蛋白质一级结构的差别分类。经典的短正五聚蛋白包括C反应蛋白和血浆淀粉样蛋白P，主要在白细胞介素6的刺激下由肝脏合成。而五聚素3是由炎性细胞因子(除了白细胞介素6)、Toll样受体激动剂，诱导多种细胞类型产生的一种长链正五聚蛋白[7-8]。白细胞介素6不能诱导活性细胞内五聚素3的合成，从而强调了长链正五聚蛋白全身性活动性与短链正五聚蛋白不同[9]。人的五聚素3基因位于染色体3(q24-28)的长臂上，包含3个外显子编码，分别用于领导肽、n-端域和五聚素3蛋白(相对分子质量40 165)的c-末端正五聚蛋白相似域[10]。五聚素3与众多免疫系统相关性疾病有着密切的关系，各系统免疫相关性疾病中都可以发现五聚素3的高表达[11]。最近的研究表明，PTX3可能具有作为临床肾脏学的治疗靶点的潜力。与健康的人肾脏相比，五聚素3在髓质外的肾小管周围内皮细胞上几乎完全表达[12]，免疫组化研究发现，在系膜区内炎性细胞浸润肾小球、间质和腹膜毛细血管均有五聚素3的表达。临床研究显示在Ⅱ型糖尿病肾脏病患者中血浆五聚素3浓度水平升高，糖尿病肾脏病伴有微量白蛋白尿时血五聚素3浓度即明显升高，随着蛋白尿的增多，血五聚素3浓度进一步升高[13]。在缺血-再灌注损伤小鼠模型中肾脏内皮细胞[14]、Ⅰ型膜性增生性肾小球肾炎患者的肾小球系膜和内皮细胞都发现五聚素3表达增加。有研究表明，在IgA肾病患者的肾活检中，在扩张系膜区域的肾小球系膜和内皮细胞中观察到五聚素3的强烈染色，而在正常肾组织和活检对五聚素3表达主要为阴性[1]。在IgA肾病中，五聚素3通过诱导继发性介质(例如血小板激活因子)的产生，参与到血管内皮细胞和内皮细胞的活化中，这一机制可能导致肾小球和肾小管间质损伤。由五聚素3与IgA肾病有关，可推测五聚素3在HPS，尤其是HSPN中可能也发挥着一定的生物功能。

本研究采用ELISA法检测HSP及过敏性HSPN患儿血浆及尿液中五聚素3的表达水平，通过比较恢复期与急性期血浆及尿液中五聚素3的表达水平，结果发现，经有效治疗后，血浆及尿液中五聚素3表达水平较治疗前显著降低，提示五聚素3表达水平的检测可以反映HSP疾病的活动状态，与多项相关性研究结果一致[1，15-19]。

此外，本研究还发现，HSP患儿血浆及尿液中五聚素3的表达水平比正常儿童血浆及尿液中五聚素3的表达水平明显升高，尤其以HSPN患儿更为显著，提示五聚素3可能成为HSP患儿肾损伤的一项新的检测指标，与Ge等[20]的研究结果一致，并且他们还发现HSPN血浆中五聚素3表达水平与尿液中微量白蛋白、24 h尿蛋白定量呈正相关。同时，有研究表明，IgA肾病患者中肾炎型、肾病型患者蛋白尿程度越重，血浆和尿液中五聚素3表达水平升高越显著，提示HSPN患儿血浆和尿液中五聚素3的表达水平肾损伤的严重程度呈正相关[21]。HSP患儿血浆及尿液中五聚素3表达水平变化的机制可能与五聚素3在血管炎症损伤中的作用密切相关。HSP患儿血浆中白细胞介素1、白细胞介素4、肿瘤坏死因子α的表达水平显著升高，这些细胞因子可促使五聚素3的生物合成增加。五聚素3还可以抑制巨噬细胞对晚期凋亡的中性粒细胞的吞噬作用，导致其在血管壁聚集，HSP时五聚素3的高表达水平有助于延迟凋亡中性粒细胞的清除，促进白细胞碎裂性血管炎的形成[22]。五聚素3亦属于成纤维细胞生长因子家族：成纤维细胞生长因子2和成纤维细胞生长因子8b的天然选择性拮抗剂，五聚素3对成纤维细胞生长因子2的特异性抑制作用能达到抗血管生成的效果。一氧化氮通路的受损是导致内皮功能障碍的主要机制之一[23]，在实验模型中，五聚素3通过P-选择素/基质金属蛋白酶1途径，使小鼠抵抗血管内皮功能受损，从而引起内皮细胞形态学改变和一氧化氮通路的受损。而在HSPN中，HSP血浆及尿液中的机制同样可以解释，有研究表明，HSPN和IgA肾病患者血浆半乳糖缺陷的IgA1(galactose-deficient IgA1，Gd-IgA1)水平显著升高，这提示Gd-IgA1在HSPN的发病机制中起到关键作用，Gd-IgA1免疫复合物在肾小球系膜区沉积，可激活系膜细胞，而系膜细胞的活化可促进五聚素3的生成[24]。此外，炎性细胞因子可以诱导肾小球上皮细胞合成五聚素3。

综上所述，五聚素3表达水平的检测不仅能反映HSP疾病的活动状态，还可能成为HSP患儿肾损伤的一项新的检测指标。