基于线粒体功能障碍探讨中医药治疗心肌缺血再灌注的研究思路❋

杨丽华，马 春，李淑玲，刘抒雯

(1. 长春中医药大学附属医院，长春 130000； 2. 长春中医药大学，长春 130000)

急性心肌梗死(AMI)已成为威胁人类健康的疾病之一[1]。流行病学调查显示[2]，我国AMI的发病率为45/10～55/10万。当心肌短暂缺血后血流灌注恢复，而复灌后缺血和组织损伤，进一步加重甚至发生不可逆性损伤的现象，这一反应称为缺血-再灌注损伤(MIRI)[3-4]。目前的治疗措施在治疗AMI的同时带来MIRI损伤。因此，MIRI发病后重视其发病机制，并进行早期干预，采取有效措施治疗，对减轻MIRI损伤、防止并发症发生及降低死亡率显得尤为重要。

研究显示[5]，线粒体损伤是心肌细胞结构与功能障碍的基本环节，其功能障碍是MIRI损伤的重要病理机制之一。线粒体功能障碍引起MIRI损伤，主要包括线粒体ATP生成减少、Ca2+超载、活性氧(ROS)大量产生及线粒体膜通透性转换孔(mPTP)持续开放，导致细胞凋亡[6-9]，加重MIRI损伤。前期研究表明[10-11]，中医药在MIRI损伤时能抑制线粒体电子传递链，调节线粒体能量代谢，抑制细胞凋亡，维持细胞内Ca2+稳态，发挥肌细胞保护作用，可作为抗心肌缺血的药物靶点。笔者拟对MIRI损伤后线粒体的结构功能改变及中医药对其具体调节作用机制进行综述，为中医药干预线粒体的病理过程提供治疗思路，对改善急性心肌梗死患者临床及预后具有重要意义。

1 MIRI损伤后线粒体结构功能变化及其损伤机制

1.1 心肌缺血后线粒体的变化及其损伤机制

线粒体功能障碍是导致心肌损伤的使动环节[12]。在MIRI损伤后，细胞内线粒体稳态平衡被打破，大量ROS释放，引起ATP合成减少，使一些ATP依赖酶类如Na+-K+-ATP酶(Na+-K+-ATPase)功能障碍。同时细胞内pH下降、H+增多，导致Na+-H+交换增多，细胞内Na+异常增多，激活Na+/Ca2+交换蛋白(NCX)的反向模式，使胞内Ca2+超载，磷酸盐浓度增加，mPTP开放与激活导致线粒体外膜破裂发生不可逆损伤，引起细胞色素C(Cytc)释放，通过Caspases等凋亡因子依赖机制细胞进入不可逆的凋亡过程，加重心肌损伤[13-15]。因此，当MIRI损伤时，线粒体的损伤情况在一定程度上决定了心肌细胞死亡数量，直接决定着患者的能否存活及生存质量。

1.2 线粒体与ROS

线粒体是氧化代谢、能量生成的场所，其呼吸功能与细胞活性密切相关。正常条件下，心肌细胞线粒体低浓度的ROS控制心肌细胞分化和兴奋-收缩偶联，不会导致机体产生严重的损害[16]。当心肌细胞在缺血缺氧的条件下，ROS能够引起蛋白质和脂质过氧化，重新激活线粒体电子传递链，引起氧自由基的清除系统功能降低，破坏心肌细胞结构，同时破坏心肌细胞膜、细胞器膜的流动性及通透性，使DNA、RNA交联甚至断裂及心肌细胞的基因结构及表达均受到影响[17-19]。此外，ROS的大量产生还引发Ca2+超载以及mPTP开放，导致Cyt-c 等一系列促凋亡因子的释放，通过凋亡的级链反应引起细胞凋亡[20]。因此改善心肌缺血血供、降低氧耗、清除或对抗有害物质对心肌的不良影响，以保护心肌线粒体是提供心肌细胞能量的主要场所。

1.3 线粒体与钙超载

生理情况下，线粒体对钙离子的摄取主要是通过依靠作为其主要动力之一的心肌线粒体膜电位(ΔΨm)帮助实现Ca2+转运[21]。1972年Shen和Jennings[22]发现，犬心脏冠状动脉短暂闭塞后复灌可加速细胞内Ca2+的积聚，使Ca2+在心肌缺血再灌注损伤中的作用成为人们研究的重点。研究表明[23-24]，当Ca2+的浓度发生增加幅度稍高，会促使发生氧化磷酸化线粒体现象，一定程度上刺激线粒体基质的Ca2+摄入，Ca2+量明显增加，Ca2+超载发生于线粒体基质中，则会发生消除ΔΨm效应。当再灌注时心肌细胞重新恢复氧供，细胞内Ca2+促进黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤氧化酶，使ROS生成增多，加重酸中毒，大量乳酸堆积反过来使线粒体膜通透性改变，线粒体结构破坏，线粒体内Ca2+以磷酸盐形式沉积，影响线粒体的氧化磷酸化过程，同时膜磷脂的降解释放大量产物如花生四烯酸、溶血磷脂，增加膜通透性，加重了线粒体内Ca2+超载[25-26]，使心肌功能进一步损伤。因此，减轻或防止线粒体 Ca2+超载和线粒体损伤，对保护缺血再灌注心肌细胞有重要意义。

1.4 线粒体与线粒体膜通透性转移孔MPTP

mPTP是位于线粒体内的非选择性、高导电性复核孔道[27]，是线粒体进行氧化应激、细胞呼吸、合成ATP等生命活动的必要条件，也是影响线粒体稳定性和细胞功能的关键因素[28]。当外界刺激较轻时，少量线粒体上mPTP一过性开放，线粒体内Ca2+释放，ATP仍可由部分未受损的线粒体提供。严重损伤时，高通透性开放状态使 ATP合成受阻，线粒体膜电位下降、细胞色素C等前凋亡蛋白释放[29]，不可逆的MIRI损伤与mPTP的激活开放密切相关[30]。在MIRI早期，ATP合成分解障碍使线粒体膜上的mPTP进一步开放。同时，呼吸链与氧化磷酸化解偶联，线粒体跨膜电位消失，H+自由在线粒体内膜两侧达到平衡，破坏线粒体质子梯度、膜电位消失，引起线粒体内离子平衡紊乱，引起外渗的细胞色素可活化，可活化凋亡执行蛋白并最终导致心肌细胞调亡[31-32]。因此，在MIRI早期有效抑制线粒体mPTP的开放，可作为MIRI损伤新的治疗策略。

1.5 线粒体与细胞凋亡

细胞凋亡病理条件下可促进细胞死亡[33]。细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤的主要原因和表现形式之一，线粒体在调节细胞凋亡过程中发挥着重要作用[34]。线粒体在凋亡信号的刺激下，通透性增大，膜电位丢失，促进凋亡因子从线粒体释放到胞质中，细胞凋亡裂解所释放的ROS又引起邻近细胞的连锁式凋亡反应。此外，线粒体内钙超载及ROS 的集聚导致mPTP大量开放，线粒体内膜完整性破坏，ATP合成功能障碍，促进细胞凋亡因子释放，加重心肌缺血再灌注损伤，因此线粒体功能障碍与否与心肌细胞的凋亡密切相关。当MIRI损伤后产生的ROS、Ca2+超载等病理变化以及线粒体损伤引起的mPTP开放，线粒体跨膜电位持续性降低，使线粒体向胞质释放凋亡因子Cyt-c和Smac(second mitochondrial-derived activator of caspase)等凋亡信号启动，这些因素虽然不能直接引起细胞凋亡，但可通过一定的信号传递方式激活生存或死亡相关基因，执行死亡功能[35-37]。

2 中医药对心肌缺血后线粒体功能的保护作用及机制

2.1 以线粒体整体功能为关键作用靶点的中药单体及复方

在MIRI损伤过程中，Ca2+超载和活性氧大量产生会造成mPTP不可逆开放。治疗过程中，抑制mPTPT的激活与开放对维持线粒体稳态对防治MIRI具有重要意义。范宗静等[38]建立MIRI大鼠模型后发现，模型组线粒体膜电位、mPTP的开放程度、线粒体钙离子浓度及ROS水平均显著升高，经黄芪多糖处理后线粒体膜电位、mPTP的开放程度、线粒体钙离子浓度及ROS水平明显降低，证实黄芪多糖通过减轻线粒体内钙超载减少ROS产生，降低膜电位水平及抑制mPTP过度开放，从而减轻MIRI对线粒体膜结构的破坏，进而保护心脏舒缩功能。此外，体外细胞(HCMEC)也证实，黄芪多糖干预后AKT和ERK1/2介导的细胞传导通路激活，进一步证实黄芪多糖对MIRI后线粒体的整体保护作用[39]。周春刚[40]等发现，当归补血汤预处理缺氧心肌细胞，细胞早期凋亡率和ROS水平均明显降低，表明当归补血汤能够提高细胞耐受氧化应激，抑制缺氧复氧损伤导致的细胞凋亡。中医药从线粒体整体保护出发，通过抑制钙超载，减少ROS产生，降低膜电位水平及抑制mPTP过度开放等多靶点治疗，进而保护心脏舒缩功能、维持心脏稳态具有重要意义。

2.2 以线粒体内钙超载为关键作用靶点的中药单体及复方

MIRI损伤时，细胞中因缺血缺氧而进行无氧糖降解，导致细胞内Na+外流、Ca2+内流引起钙超载[41]。朱宁等[42]发现，缺氧组心肌细胞肌浆网钙泵(SERCA)活性下降，细胞内钙离子浓度增加，红景天苷治疗后，心肌细胞SERCA活性增加，细胞内钙离子含量显著降低，说明红景天对缺氧的乳鼠心肌细胞损伤的保护可能与其能升高SERCA活性、减轻钙超载有关。宋丽华等[43]发现，白藜芦醇组线粒体中琥珀酸脱氢酶(SDH)、钠钾腺苷三磷酸酶(Na+-K+-ATPase)、钙腺苷三磷酸酶(Ca2+-ATPase)的活性明显提高，线粒体内钙离子浓度明显下降，mPTP开放程度减小，线粒体膜电位增高；Ca2+-ATPase、热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)在mRNA或蛋白水平上的表达均有所增加，证实白藜芦醇保护MIRI可能是通过增加心肌组织中Ca2+-ATPase、HSP70mRNA蛋白的表达，从而提高线粒体Ca2+-ATPase的活性，产生对大鼠心肌缺血再灌注损伤时线粒体的保护作用。因此，中医药抑制Ca2+的作用机制可能与影响细胞膜上钙通道的开放，干预Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase，提高心肌肌质网钙泵活性及双重细胞和线粒体钙浓度，发挥心肌线粒体保护功能。

2.3 以线粒体内氧自由基为关键作用靶点的单体及复方

氧化应激损伤在心肌缺血尤其是再灌注时起关键作用。王佳等[44]研究发现，熊果酸可明显减少心肌丙二醛(MDA)和脂质过氧化物(LPO)的表达水平，以及血总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)含量，增加心肌过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及血清高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)的含量，提示熊果酸可通过抑制氧化应激和脂质过氧化反应减轻ROS诱发的线粒体功能障碍，从而减轻MIRI损伤。关凤英等[45]证实，黄芪甲苷能够显著降低MDA含量和乳酸脱氢酶(LDH)的漏出量，增强SOD活力，并能改善细胞器形态，激活线粒体ATP敏感性钾离子通道(mitoK ATPC)，使线粒体信号传导通路受抑制，最终减少心肌细胞凋亡。保善录等[46]用4味辣根菜汤散给药后，大鼠SOD活性升高，MDA含量降低，其对MIRI损伤心肌的保护作用可能是通过促进抑制自由基的产生，增强自由基清除剂的功能，从而维持心肌细胞氧化和抗氧化的动态平衡，发挥保护心肌细胞保护作用。因此，中医药针对氧化应激的作用机制可能与抑制自由基产生、提高线粒体抗氧化能力损伤密切相关。

2.4 靶向线粒体内mPTP的中药单体及复方

mPTP异常高水平开放可导致能量生成障碍及诱导细胞死亡。李剑等[47]建立大鼠MIRI损伤模型后发现，再灌注期心肌细胞上的线粒体 mPTP呈开放状态，给予葛根素治疗后恰好能抑制线粒体mPTP的开放，减少心肌细胞Caspase-3的大量释放，从而能抑制心肌细胞的大量凋亡，同时葛根素组的自噬特异性标志物LC3 II、Beclin1显著减少，说明葛根素减少心肌缺血再灌注梗死面积，其可能的作用机制是抑制线粒体mPTP开发，从而减轻心肌细胞大量和自噬性死亡。贺永贵[48]等结扎冠状动脉进行心肌缺血建立离体MIRI模型，给予黄芪甲苷治疗后心功能显著改善，心肌梗死面积明显减少，线粒体肿胀程度缩小，同时给药后使再灌注5 min和10 min的GSK-3β磷酸化明显增加，说明黄芪甲苷通过使GSK-3β失活而抑制mPTP，证实黄芪甲苷对MIRI保护作用可能与抑制GSK-3β 活性、进而阻止mPTP开放有关。李玉红等[49]将参麦注射液与丹参注射液联合应用发现，离体心脏mPTP更容易开放，表明其含有较多未开放的线粒体，提示其联合应用在体时可能减少诱发mPTP开放的因素，使再灌注期间活性氧类物质的产生及线粒体钙超载降低，从而“间接”抑制mPTP开放，减少其凋亡或坏死的发生，保护线粒体的完整性。中医药能够以mPTP为靶点治疗mIRI损伤，其具体作用机制可能与通过作用于mPTP结构成分，直接抑制mPTP开放及通过降低mPTP开放诱导剂的水平间接抑制mPTP开放有关。

2.5 靶向线粒体内细胞凋亡中药单体及复方

线粒体内细胞凋亡是MIRI损伤的最终结果，PI3K-Akt信号通路具有调节细胞分化、增殖、凋亡等作用，是调控心肌细胞存活的一个重要通路[50]。张月红[51]等在研究丹参饮提取物A抗心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡的作用机制时发现，丹参饮提取物A组心肌细胞凋亡指数比模型组明显降低，Bcl-2、GSK-3β蛋白表达水平明显升高，Bax蛋白和Caspase-3蛋白的表达水平明显降低，同时P-Akt蛋白表达增加，说明PI3K-Akt 信号通路参与了心肌缺血损伤的发生过程，丹参饮提取物对心肌缺血细胞凋亡的干预作用可能是通过PI3K-Akt信号传导通路实现的。于鑫鑫等[52]发现，甘草酸能显著降低MIRI细胞凋亡率，减少脑组织MKK/JNK信号通路蛋白[丝分裂原活化蛋白激酶4/7(p-MKK4/7)]、c-Jun氨基末端激酶1/2/3(p-JNK1/2/3)、Caspase-8、Bax、Caspase-3表达，提高Bcl-2表达水平，同时甘草酸组较模型组心肌细胞水肿程度轻且炎性细胞少。林凯旋等[53]制备大鼠MIRI模型，观察益气化瘀方对心肌细胞相关凋亡蛋白的影响，发现益气化瘀方能明显减少促心肌细胞凋亡的相关调节蛋白Bax、Caspase-3、Fas及P53的表达，增加抑制心肌细胞凋亡相关调节蛋白Bcl-2的表达，发挥心肌保护作用。因此，中医药能够抑制细胞凋亡因子的产生，提高抗细胞凋亡因子活性，并通过调控多细胞间信号通路发挥抗凋亡作用。

3 思考与展望

基于线粒体的整体结构完整和功能稳定，对于MIRI治疗提供了新的靶点及研究思路。中医药具有多组分、多靶点、多环节、多途径的优势和特点，随着中医药抗MIRI作用机制的深入研究，调控线粒体结构功能被证实是中医药对心肌保护作用的机制之一。上述研究证实，中药单体及复方均能调控细胞内氧化应激，减少Ca2+超载，稳定线粒体结构功能，抑制mPTP开放，最终抑制细胞凋亡而减轻MIRI损伤。但现有研究对线粒体结构功能及中医药治疗作用机制尚未深入研究及系统评价，以下问题有待解决：一是大多数仍停留在单一机制的研究，同一指标多次检测、同一中药单体及复方反复验证，降低了中药在治疗MIRI的突出优势；二是在相关蛋白信号通道及基因等深层次方面研究较少，不能很好地体现中药对MIRI作用机制的多环节、多途径、多靶点特点；三是对中药作用机制的研究大多借鉴西药的研究模式，在中医辨证方面的研究极少，忽视了中医药理论的指导；四是实验动物模型的制备仅具有MIRI疾病的特征，而未按中医学“证”出发，与辨证论治不相符，在临床运用中有一定的盲目性；五是未深入研究线粒体与其他组分间相互影响机制，中医药调控线粒体稳态及怎样将现有的研究成果与临床实际结合更好地解决实际应用，可能都是今后需要研究和解决的问题。因此，基于中医“整体观念，辨证论治”的理论，开发疗效确切的新药，重视线粒体与其他影响MIRI组分之间的相互作用，将西医辨病与中医辨证相结合， 对病、 证、方药有机结合研究，同时加强miRNA基因调控等细胞分子层面对线粒体代谢等基础研究，探索其相关调控机制和信号分子改变，阐明其防治MIRI的物质基础和主要作用机制，在临床研究中进行更为科学的设计，扩展更大的样本量，进行分类系统研究，提高对MIRI机制的研究，并能够为临床治疗MIRI提供潜在的治疗策略和理论依据。