沉默精子相关抗原9对膀胱癌细胞的影响

邢家伟，许长宝，赵兴华，赵永立，吕 远，王红丹

膀胱癌是一种恶性肿瘤，部分患者可通过手术治疗的方法得以控制，但目前对于膀胱癌患者预后复发率高、转移率高的问题依然缺少高效的控制方法[1]。研究[2]表明，精子相关抗原9(sperm associated antigen 9, SPAG9)在正常机体曲细精管的精子中特异性表达。研究[3-5]显示，在乳腺癌、宫颈癌、肺癌等组织或血清中表达量均异常，表明SPAG9参与肿瘤的发生、发展。但SPAG9在膀胱癌细胞中的表达量以及具体作用机制的相关研究较为少见。该研究通过检测SPAG9在膀胱癌细胞中的表达状况，分析沉默SPAG9在膀胱癌的发生发展中的作用，为其膀胱癌的诊断和临床治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株 人膀胱癌细胞系T24、J28、RT4以及人膀胱上皮细胞SV-HUC-1均购自美国模式菌种收集中心(ATCC)。

1.1.2实验主要试剂及仪器 McCoy’s 5A培养基、DMEM培养基、F12K培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；TRIzol、反转录试剂盒购自大连TaKaRa公司；β肌动蛋白(β-actin)抗体、SPAG9抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；膜联蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)凋亡检测试剂盒、Matrigel胶购自美国BD公司；噻唑蓝(MTT)试剂盒、二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)、Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；Transwell小室购自美国Millipore公司；B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2, Bcl-2)抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)抗体购自美国Sigma公司；增殖细胞核抗原(poliferating cell nucler antigen, PCNA)抗体、细胞核相关抗原Ki-67(nuclear associated antigen Ki67, Ki-67)抗体购自Cellular Signaling Technology公司；基质金属蛋白酶-2(matrixmetalloprotease 2, MMP-2)抗体、基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloprotease 9, MMP-9)抗体购自武汉博士德公司;荧光定量PCR仪(LightCycler® 480)购自美国Roche公司；凝胶成像系统(Syngene G:BOX)购自英国SynGene公司。

1.2方法

1.2.1细胞的培养 膀胱癌T24、J28细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，RT4细胞置于含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中，膀胱上皮细胞SV-HUC-1置于F12K培养基中，均放入37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中，收集对数期细胞进行后续实验。

1.2.2实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中SPAG9 mRNA的表达量 SPAG9引物在Primer 5.0软件中进行设计并由上海生工合成，见表1。每孔细胞中加入1 ml TRIzol并置于冰上5 min，提取细胞中总RNA。吸取5 μg细胞总RNA，65 ℃变性10 min，冰浴2 min，根据反转录试剂盒说明书合成cDNA，保存于-20 ℃。根据SYBR Premix Ex Taq试剂盒所示，以cDNA为模板，以β-actin为参照反应条件为94 ℃、 4 min，94 ℃、 30 s，56 ℃ 、30 s，72 ℃、 30 s，40个循环。实验重复3次，2-ΔΔCt法计算SPAG9的相对表达量。

表1 引物序列

1.2.3Western blot法检测SPAG9蛋白的表达水平 弃去培养基，加入蛋白裂解液，冰浴5 min，离心，收集上清液，吸取2 μl进行浓度测定，其余蛋白样品与适量5×上样缓冲液混合均匀，煮沸5 min；配置适宜浓度的分离胶，吸取40 μg蛋白样品加入上样孔中，恒压为80 V，电泳至蛋白质进入分离胶，调整为恒压120 V，电泳至蛋白迁移至分离胶底部；恒定电流300 mA转膜150 min；将PVDF膜浸泡与5%的奶粉溶液中，室温孵育2 h；加入一抗工作液，4 ℃孵育过夜，TBST漂洗3次，每次10 min，加入二抗，37 ℃孵育2 h，TBST漂洗3次，每次10 min，避光，加入ECL发光液，凝胶成像仪中检测，分析蛋白质灰度值。

1.2.4细胞的转染 以膀胱癌T24细胞作为后续实验研究对象，稳定传代后进行转染。将膀胱癌T24细胞分为3组：对照组、转染无义组、siRNA-SPAG9组。转染前24 h，每孔接种3×105个细胞，转染前6 h更换为无血清培养基。分别将siRNA和Lipofectamine 2000溶于无血清培养基中，然后混合均匀，室温孵育10 min，形成复合物；每孔细胞中加入上述复合物，37 ℃培养6 h，更换为完全培养基继续培养。qRT-PCR和Western blot检测转染后细胞中SPAG9 的表达量。

1.2.5MTT检测细胞的增殖 以每孔5×103个接种，转染，培养箱中培养48 h后，每孔加入20 μl MTT，37 ℃培养4 h，弃去上清液，每孔加入100 μl DMSO，避光振荡20 min，检测细胞在490 nm的吸光值(A490 nm)。

1.2.6流式细胞术检测凋亡率 取转染后48 h细胞，无菌磷酸盐缓冲液清洗，调整细胞浓度为1×105/ml，加入100 μl 1×缓冲液，每孔加入5 μl Annexin V-FITC混匀，室温孵育15 min，每孔加入5 μl碘化丙啶(propidium iodide, PI)，流式细胞仪检测凋亡的细胞，计算细胞总的凋亡率。

1.2.7细胞的迁移、侵袭实验 收集各组细胞，计数，调整为1×105个/ml；将Transwell小室置于24孔细胞培养板中，吸取200 μl细胞悬液加入上层上室内，下室加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培养基，37 ℃培养24 h；弃去上层培养基，擦去上层细胞、Matrigel胶，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%结晶紫染色20 min，显微镜下随机取5个区域拍照、计数，每孔设置5个复孔，实验重复3次，取平均值。在侵袭实验过程中，按1 ∶8的比例将Matrigel胶与无血清DMEM培养基混匀，取80 μl均匀覆盖在小室膜中，其余实验步骤同迁移实验。

1.2.8Western blot检测细胞恶性表型相关蛋白的水平 根据1.2.3所示，检测各组细胞中Bcl-2、Bax、PCAN、Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白的水平。

2 结果

2.1SPAG9在膀胱癌以及正常上皮细胞中的表达量SV-HUC-1细胞和膀胱癌T24细胞、J28细胞、RT4细胞的SPAG9 mRNA和蛋白的表达量整体比较差异具有统计学意义(F=63.639,P=0.000;F=73.581,P=0.000)。SPAG9 mRNA的表达量分别为(1.000±0.023)、(6.589±0.741)、(4.865±0.520)、(4.573±0.467)，蛋白的表达量分别为(0.158±0.012)、(0.769±0.068)、(0.524±0.053)、(0.489±0.052)；结果如图1所示，qRT-PCR实验结果表明，与膀胱上皮SV-HUC-1细胞比较，SPAG9 mRNA在膀胱癌T24、J28、RT4细胞中的相对表达量显著增加(P<0.05)；与T24细胞比较，SPAG9 mRNA在J28、RT4细胞中的表达量显著降低(P<0.05)。Western blot实验结果亦显示，SPAG9蛋白在膀胱癌T24、J28、RT4细胞中的相对表达量较SV-HUC-1细胞显著增加(P<0.05)；与T24细胞比较，SPAG9蛋白在J28、RT4细胞中的表达量显著降低(P<0.05)。

2.2转染后T24细胞中SPAG9的表达量结果如图2所示，对照组、转染无义组、siRNA-SPAG9组细胞中SPAG9 mRNA、蛋白质水平整体比较差异具有统计学意义(F=271.950,P=0.000;F=92.969,P=0.000)。对照组、转染无义组、siRNA-SPAG9组细胞中SPAG9 mRNA的表达量分别为(1.003±0.024)、(1.000±0.016)、(0.427±0.053)，SPAG9蛋白水平分别为(0.813±0.074)、(0.798±0.062)、(0.254±0.023)。转染后，T24细胞中SPAG9 mRNA和蛋白的表达量较对照组显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图1 SPAG9在膀胱癌以及正常上皮细胞中的表达量

与SV-HUC-1细胞比较：*P<0.05；与T24细胞比较：#P<0.05

图2 转染后T24细胞中SPAG9的表达量

2.3沉默SPAG9对膀胱癌细胞增殖的影响结果如图3所示，对照组、转染无义组、siRNA-SPAG9组细胞在490 nm波长下的吸光值分别为(1.236±0.214)、(1.258±0.223)、(0.567±0.053)。3组细胞在490 nm波长下的吸光值整体比较差异具有统计学意义(F=14.118,P=0.005)；转染后，T24细胞的增殖较对照组显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.4沉默SPAG9对膀胱癌细胞凋亡的影响结果如图4所示，对照组、转染无义组、siRNA-SPAG9组细胞的凋亡率分别为(6.521±0.784)%、(5.872±0.736)%、(17.489±2.553)%。3组细胞的凋亡率整体比较差异具有统计学意义(F=49.974,P=0.000)；转染siRNA-SPAG9后，T24细胞的凋亡率较对照组显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图3 沉默SPAG9 对膀胱癌细胞增殖的影响

2.5沉默SPAG9对膀胱癌细胞侵袭、迁移的影响结果如图5所示，对照组、转染无义组、siRNA-SPAG9组迁移细胞数分别为(369.587±23.786)个、(374.586±25.598)个、(153.226±12.147)个；侵袭细胞数分别为(169.557±18.456)个、(158.236±16.745)个、(82.451±9.227)个。3组的迁移细胞和侵袭细胞数分别整体比较差异具有统计学意义(F=105.040,P=0.000;F=28.589,P=0.001)；转染siRNA-SPAG9后，T24细胞的侵袭、迁移能力较对照组显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.6沉默SPAG9对膀胱癌细胞恶性表型相关蛋白水平的影响结果如图6、表2所示，以β-actin为参照，对照组、转染无义组、siRNA-SPAG9组细胞恶性表型相关蛋白具有显著变化。与对照组比较，siRNA-SPAG9组细胞中PCAN、Ki67、Bcl-2蛋白的表达量显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，Bax蛋白显著上调(P<0.05)，MMP-2、MMP-9蛋白显著下调(P<0.05)。

3 讨论

据统计，在我国，膀胱癌的发病率居泌尿系统肿瘤的首位，其中男性的发病率高于女性[6]。膀胱癌术后易发生转移，5年存活率较低，预后较差，治疗费用较高，给患者以及社会带来了沉重的经济负担。目前，寻找膀胱癌治疗的分子靶向标志物，使其服务于膀胱癌的诊断以及临床治疗具有重要的意义。SPAG9是目前新发现的肿瘤睾丸抗原之一，调控肿瘤癌基因的水平以及细胞的扩增等。早期人们认为SPAG9只特异性表达于睾丸组织中，不表达于正常组织，调控精卵结合的过程。但近年来的研究[7-9]显示，SPAG9在肿瘤组织或者血清中发挥较强的免疫原性作用。SPAG9通过与多种细胞因子以及蛋白结合，从而激活细胞中的信号通路，调控人体多种生理过程，与机体某些疾病和肿瘤的演进密切相关，因此SPAG9可能是肿瘤生物治疗的潜在靶点[10-13]。以人膀胱上皮细胞SV-HUC-1和膀胱癌T24、J28、RT4细胞系作为体外实验的研究对象，qRT-PCR和Western blot检测结果显示，SPAG9在膀胱癌T24、J28、RT4细胞系中的表达量显著高于膀胱上皮细胞SV-HUC-1，提示SPAG9在膀胱癌的差异表达与膀胱癌细胞的恶化过程密切相关。

图4 沉默SPAG9 对膀胱癌细胞凋亡的影响

蛋白对照组转染无义组siRNA-SPAG9组F值P值PCAN0.541±0.0470.568±0.0500.236±0.018∗60.7920.010Ki-670.478±0.0390.486±0.0430.216±0.025∗53.1700.012Bcl-20.685±0.0630.679±0.0580.241±0.032∗69.8250.015Bax0.257±0.0210.263±0.0270.692±0.057∗126.7150.008MMP-20.258±0.0260.274±0.0230.124±0.017∗40.8760.018MMP-90.341±0.030.336±0.0350.154±0.012∗42.6980.009

与对照组比较：*P<0.05

图5 沉默SPAG9 对膀胱癌细胞侵袭、迁移的影响

图6 沉默SPAG9 对膀胱癌细胞恶性表型相关蛋白水平的影响

大量研究显示，探究肿瘤转移、浸润的机制，寻找合适的分子靶点，对提高肿瘤患者的5年生存率以及改善预后不良、降低治疗费用具有重要的意义。肿瘤细胞的过度增殖是恶性肿瘤发生、发展的重要生物学特征。肿瘤细胞的增殖涉及多种信号因子或者相关信号通路的激活，促进细胞的增殖。SPAG9在多种肿瘤的恶性发展中发挥重要作用。应用siRNA技术，沉默膀胱癌T24细胞中SPAG9的表达后，T24细胞的增殖受到明显抑制，凋亡率显著增加，细胞的侵袭、迁移能力显著降低，表明SPAG9在膀胱癌细胞的恶性生物学特性中发挥重要作用。

大量研究[14]表明，SPAG9与多种肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移密切相关。SPAG9在肺癌组织以及血清中的表达量异常，可作为肺癌诊断的分子标志物。SPAG9可通过降低MMP-9、激活相关信号通路，从而调节肺癌的转移能力;在前列腺癌中，SPAG9可通过调节细胞周期相关蛋白Cyclin D1、Cyclin E水平，从而对肿瘤细胞产生明显的抗肿瘤作用[15]。为了研究SPAG9对膀胱癌细胞生物学特性的作用机制，对细胞增殖、细胞凋亡以及侵袭迁移相关蛋白PCAN、Ki-67、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9等进行了检测，分析沉默SPAG9后，上述蛋白水平的变化。结果显示，下调膀胱癌细胞中SPAG9基因的表达量，细胞增殖相关蛋白PCAN、Ki-67的表达量降低；与对照组比较，细胞抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达量显著降低，促凋亡蛋白Bax的水平明显增加；细胞侵袭、迁移相关蛋白MMP-2、MMP-9的表达量较对照组显著下调，表明SPAG9可能通过调控细胞恶性表型相关蛋白，从而激活更多的信号转导通路来发挥其抗肿瘤的作用。

综上所述，研究显示，SPAG9在膀胱癌细胞中的表达量上调，表明SPAG9与膀胱癌的发生、发展有关；沉默SPAG9可通过调节细胞恶性表型相关蛋白的表达量，抑制膀胱癌细胞的增殖，促进其凋亡，降低细胞的侵袭、迁移能力，可作为膀胱癌诊断和预后评估的生物学标志以及分子靶向治疗的潜在靶点。