L-02细胞上清液对TGF-β1刺激HSC细胞α-SMA表达的影响

钟毓娟，吴 丹，黄光玲，何 义，蒋莲秀

共培养体系是指将两种细胞(可以来自同一组织,也可以来自不同的组织)混合共同培养,通过两种细胞之间的相互作用,观察细胞共培养后其功能、特性、生长行为等的变化,如某一细胞的分泌物对另外一种细胞基因表达的影响等[1]。研究[2]表明转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1既可通过促进人肝星状细胞(human hepatic stellate cells，HSC)合成Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型胶原及纤维连接蛋白等增加细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的合成，又可通过抑制基质金属蛋白酶合成、促进HSC分泌组织金属蛋白酶抑制剂而减少ECM降解。课题组前期通过TGF-β1刺激HSC-LX-2建立α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)过表达的细胞模型[3]，在此基础上，该研究收集人正常肝细胞(human normal liver cell，L-02)细胞上清液与HSC-LX-2细胞间接共培养，以观察在TGF-β1刺激下L-02上清液对HSC-LX-2细胞α-SMA表达的影响。

1 材料与方法

1.1细胞来源L-02、HSC-LX-2均购自无锡博慧斯生物医药科技有限公司。

1.2试剂重组人TGF-β1购自美国Novoprotein公司;兔抗鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)单克隆抗体、鼠抗α-SMA单克隆抗体购自上海生工生物工程股份有限公司；辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)标记山羊抗鼠二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Hyclone胎牛血清购自美国Thermo公司；双抗、高糖DMEM培养基购自杭州赛默飞世尔仪器有限公司；普通ECL Plus发光液购自北京泛博生化公司。

1.3仪器Model311型CO2培养箱、酶标仪(Model450)均购自美国Thermo公司；电泳仪、半干转膜仪购自美国Bio-Rad公司；多通道PCR仪(PTC-220)购自美国MJ公司；核酸蛋白分析仪(PPSQ-31A型)购自日本岛津公司；全自动凝胶成像分析系统(JS-780型)购自上海培清科技公司。

1.4方法

1.4.1细胞培养 HSC-LX-2、L-02均置于含10%胎牛血清、双抗(100 U/ml青霉素和100 mg/L链霉素)的高糖DMEM培养液，37 ℃、5% CO2条件下培养。

1.4.2L-02上清液的制备 取对数生长期细胞L-02接种于面积为25 cm2的培养瓶中，1.5×106个细胞/瓶，5 ml 10%胎牛血清/瓶，培养箱培养24 h，收集其细胞培养上清液，1 000 r/min离心5 min，取其上清液于-20 ℃备用。临用前把此上清原液用1.4.1中的培养液稀释，浓度分别为1 ∶2、1 ∶4，分为L-02细胞上清原液、1/2上清液、1/4上清液。

1.4.3MTT法检测LO2上清液对TGF-β1诱导HSC-LX-2细胞增殖的抑制作用 取对数生长期细胞HSC-LX-2接种于96孔板，3×103个细胞/孔，培养箱培养24 h 后，分成正常组、模型组、L-02细胞上清原液组、1/2上清液组、1/4上清液组。正常组只含有培养液；模型组含终质量浓度为5 μg/L[4]的TGF-β1；上清液各组分别在加入L-02细胞上清原液、1/2上清液、1/4上清液的基础上，加入终质量浓度为5 μg /L 的TGF-β1。继续培养68 h后，避光加MTT 20 μl，继续培养4 h，弃去上清液，加入二甲基亚砜150 μl，室温下低速振荡10 min，酶标仪490 nm波长检测光密度(optical density，OD)值，重复3次取平均值。利用公式计算细胞抑制率。细胞抑制率(%)=(模型组OD值-上清液组OD值)/模型组OD值×100%。

1.4.4Western blot法检测HSC-LX-2细胞α-SMA的表达 取对数生长期细胞HSC-LX-2细胞接种于直径10 cm的大皿，2×106个细胞/皿，细胞分组、干预同1.4.3。培养72 h后弃去上清液，冰上用生理盐水清洗培养皿3次，放射免疫沉淀试验(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解缓冲液裂解细胞，收集细胞裂解物。4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液，BCA法检测各组蛋白含量。取含100 μg 总蛋白的上清液, 100 ℃水煮5 min，聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后把蛋白转移到硝酸纤维膜上，5 %脱脂牛奶封闭1 h，TBST洗脱4次，每次5 min。加入α-SMA一抗(1 ∶500)孵育，室温孵育2 h后4 ℃摇床过夜(16～18 h)。第2天TBST冲洗4次，每次5 min，再与二抗(1 ∶8 000)室温作用1 h，TBST冲洗4次，每次5 min，暗室用ECL发光液发光显色，用自动凝胶成像分析系统定量分析印迹。GAPDH为内参。

1.4.5逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测HSC-LX-2细胞α-SMA mRNA的表达 ① 取呈指数生长的HSC-LX2细胞接种于直径10 cm的大皿，2×106个细胞/皿，细胞分组、干预同前;② 用TRIzol法提取HSC-LX2中总RNA。用核酸蛋白测定仪测定RNA含量和纯度;③ 取5 μg 总RNA，用RNA逆转录酶将其逆转为cDNA;④ 根据引物说明书，引物序列：α-SMA：F:5’-GTCCCAGACATCAGGGAGTAA-3’;R:TCGGATACTTCAGCGTCAGGA-3’;α-actin:F:5’-TGTTACCAACTGGGACGACA-3’:R:GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA;⑤ PCR扩增，PCR反应总体积为20 μl，热循环条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸2 min；35个循环，72 ℃延伸5 min；⑥ 分别取10 μl扩增产物和DNA Marker上样，进行琼脂糖凝胶电泳，DNA带进行观察和紫外线灯拍摄。Gel Doc XR系统检测OD值，Quantity One软件进行分析，β-actin为参照物。实验重复3次。

1.5统计学处理采用SPSS 18.0软件进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。P<0.05为差异有统计学意义。作图软件为GraphPad Prinm5。

2 结果

2.1L-02上清液对TGF-β1诱导HSC-LX-2细胞增殖的抑制作用L-02上清液作用72 h后，对TGF-β1刺激HSC- LX-2细胞的增殖有一定抑制作用，且与浓度有关，上清原液的抑制率达到38.90%， 1/2上清液组抑制率为20.82%。见表1。

表1 L-02上清液对TGF-β1诱导HSC- LX-2细胞增殖的影响

2.2L-02上清液对HSC-LX-2细胞α-SMA蛋白表达的影响L-02细胞上清液与HSC- LX-2细胞共培养后，上清原液组、1/2上清液组HSC- LX-2细胞α-SMA蛋白的表达明显降低(F=44.125，P<0.01)。见图1。

图1 L-02上清液对HSC-LX2细胞α-SMA表达的影响

1：正常组；2：模型组；3：上清原液组；4：1/2上清液组；5：1/4上清液组;与正常组比较：#P<0.05；与模型组比较：*P<0.05,**P<0.01

2.3对HSC-LX-2细胞α-SMAmRNA的表达L-02细胞上清液与HSC- LX-2细胞共培养后，上清原液组、1/2上清液组中HSC- LX-2细胞α-SMA mRNA的表达降低(F=45.231，P<0.01)。见图2。

图2 L-02上清液对HSC-LX-2细胞α-SMA mRNA表达的影响

A：β-actin; B:α-SMA;1：正常组；2：模型组；3：上清原液组；4：1/2上清液组；5：1/4上清液组；与正常组比较：#P<0.05；与模型组比较：*P<0.05,**P<0.01

3 讨论

在正常肝组织中，各种细胞及ECM有着精确的相对比例和特定的相对空间位置，通过细胞之间、细胞与ECM之间的信号传递精确地调控着结构、功能和代谢状态，成为一个相对稳定的微生态系统[5]。肝纤维化(hepatic fibrosis HF)是多种原因引起的慢性肝损害所致的病理改变，而HSC活化、增殖及转分化为肌成纤维细胞则被认为是HF发生发展的核心机制[6]。TGF-β1具有细胞黏附、迁移、抑制大多数细胞的增殖、诱导细胞分化、调节免疫细胞的增殖与分化、免疫应答以及促进ECM与胶原生成等多重的生物学作用[7],是最主要的促纤维化因子，与 HF 发生、发展密切相关[2]。TGF-β1可刺激纤维黏连蛋白、胶原等 ECM 成分的合成与分泌，降低ECM 蛋白酶的活性，减少 ECM 降解[8]，刺激HSC活化。 HSC激活后产生大量的肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor HGF)， HGF可以通过减少 TGF-β1合成并抑制其信号转导、抑制 HSC 活化和增殖，使其具有抗纤维化效应[9]。L-02具有分泌HGF等多种细胞生长因子[10]的功能。但由肝实质细胞直接产生HGF的量很少，主要由肝间质细胞产生[11]。本实验中， HSC-LX-2细胞被TGF-β1激活，模型组HSC-LX-2细胞自身分泌的HGF不能抑制α-SMA蛋白的表达，加入L-02细胞上清液后，随着上清液浓度的增加，HSC-LX-2细胞的α-SMA及α-SMA mRNA的表达逐渐降低，表明HSC-LX-2细胞自身产生的HGF单独作用于TGF-β1时，对HSC-LX-2细胞的α-SMA及α-SMA mRNA的表达没有影响，提示HSC-LX-2细胞自身分泌的HGF需要通过不同细胞的分泌因子、分泌因子和细胞的相互作用等才能发挥抑制 HSC 活化和增殖的功能，从而抑制蛋白α-SMA的表达。但L-02细胞上清液成分及激活HGF的机制尚待进一步的研究。