重楼属植物规范化生产种植的研究概况Δ

刘 斌，邵美玲，杨光义，杨 洋，冯光军#

(1.湖北医药学院附属十堰市太和医院药学部，湖北 十堰442000； 2.深圳市宝安纯中医治疗医院药学部，广东 深圳 518000)

重楼为百合科植物七叶一枝花ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara.或云南重楼ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz.的干燥根茎[1]。重楼药用历史悠久，具有较高的药用价值，其味苦，性微寒，有小毒，归肝经，具有清热解毒、消肿止痛和凉肝定惊之功效，主要用于治疗疔疮痈肿、咽喉肿痛、蛇虫咬伤、跌扑伤痛和惊风抽搐等[2-3]。重楼属植物在全世界有28种[4]，在我国有19种18变种，其资源主要分布于西南各省区(云南省、四川省及贵州省)[5]，目前分布较广的品种是七叶一枝花和云南重楼[6]。历版《中华人民共和国药典》收载的重楼基源植物均为七叶一枝花和云南重楼[1]。重楼主要的活性物质为甾体皂苷，主要成分有甾醇、甾醇苷、黄酮苷及C21孕甾烷型苷等多种化合物，还含有多种氨基酸和微量元素[7-8]。重楼的药理作用体现在对机体多个系统都具有影响，具体可用于子宫出血、泌尿系统感染、外科炎症、恶性肿瘤及避孕等方面[9-10]。重楼药用价值高，在临床得以广泛应用，是云南白药制剂、季德胜蛇药片及宫血宁胶囊等多种名贵中成药的重要组方药物，市场需求量大。而药用重楼主要依靠野生资源，利益的追求导致近年来我国大部地区野生重楼都遭到过度采挖，致使野生资源愈发趋于枯竭，每年的消耗量远远超出了其年生长量[11-12]；加之市场需求的不断扩大，规范化种植成为必然选择。重楼为多年生草本植物，生长周期缓慢，从出苗到药用需要5～8年，有胚后熟的特性，种苗繁殖率低，资源再生缓慢[6]。如何缩短重楼生长周期，在较快的时间内使其品质达到药用标准，加快重楼栽培繁育技术研究是缓解供需矛盾的关键，也是迫切需要解决的关键问题。但目前对于重楼的栽培繁育技术及规范化种植技术都尚未取得令人满意的结果，制约了重楼的产业化进展，进行重楼的栽培繁育研究与原生态规范化种植技术研究迫在眉睫。查阅历代本草和现代文献发现，近几十年来国内外学者多关注重楼的药理作用和临床应用的研究，而对重楼的规范化规范化生产种植关键技术缺少系统性的研究。因此，针对当下野生重楼资源濒临枯竭的现状，需要及时有效地对这些研究动态及特点进行分析总结，以为下一步的重楼规范化生产种植提供基础。现根据重楼药材规范化生产种植过程中所涉及到的种质资源、组织培养技术、化学成分和药理作用、药材质量控制及品质评价等方面的内容，分别作如下总结。

1 重楼的种质资源调查和品种鉴定

重楼为多年生草本植物，其根可入药，因在每轮叶片之上还有一轮叶片状花萼拟为2层绿叶，故名重楼。重楼药用历史悠久，以“蚤休”之名首载于《神农本草经》[13]，列为下品，是临床常用中药；《唐本草》曰：“今谓重楼者是也，一名重台，南人名草甘遂，一茎六七叶，似王孙、鬼臼、蓖麻辈，叶有二三层，根如肥大菖蒲，细肌脆白”；又曰：“根摩醋，傅痈肿蛇毒，甚有效”；《日华子本草·蜀本草》称重楼为“螫休”[14]；《本草图经》称之为“紫河车”[15]；《本草蒙筌》称之为“七叶一枝花”。《本草纲目》云：“一层七叶，茎头夏月开花，一花七瓣……虫蛇之毒，得此治之即休，故有蚤休、螫休诸名”[16]；《植物名实图考》中曰：“蚤休通呼草河车，亦曰七叶一枝花，为外科要药”。以上所述，与现今之重楼相符，历版《中华人民共和国药典》予以收载。重楼生长条件较苛刻，在欧亚大陆的温热带区域分布较广，据资料记载，重楼属植物在欧亚大陆的地理分布和遗传多样化中心是以横断山脉南段为核心区域的四川、云南2省，作为药源的重楼是侧膜亚属的种，集中分布于西南地区云南、贵州和四川3省[5]。目前，我国重楼的人工规范化生产种植基地多集中于云南省等地区，种植品种多为云南重楼。本课题组充分利用湖北省西北地区的地理和气候条件优势，分别在武当山(伏龙山龙王寨)和神农架(木鱼镇千家坪)选取野生重楼植株分布密集的生长环境作为种植示范基地，并发展林下仿野生生态种植示范基地，面积达400余亩，每亩种植收益为10万～16万元，也是带动山区百姓脱贫致富的稳妥可靠的项目，在上述地区显现出了极大的价值。

重楼的人工栽培和种植过程中，由于种植人员缺乏对物种的鉴定，常出现种植品种不确定或同一片药田中多种重楼混种的现象，成熟采收后均作为重楼药材流入市场，严重影响重楼药材的质量。目前，重楼种植最广泛的品种为云南重楼和华重楼，但经常与毛重楼和长药隔重楼混种混用，主要由于其茎都显绿色或紫色，叶形都呈披针形、倒披针形，其差别主要在于花和果实，难以辨别区分。由于重楼种属繁多，且不同种属重楼的根茎形态、组织结构相似，非专业或未经过相关培训的人士很难鉴别。而不同种属重楼所含成分及含量有较大差别[17-18]。仅以原植物形态特征(形态、大小及色泽等)、药材性状和显微鉴定等传统鉴定方法或《中华人民共和国药典》所述含量(水分、灰分及皂苷含量等)来鉴定重楼种属的难度较大，因此，在现有基础上建立快速、有效的鉴定重楼的方法十分必要。

中药的使用必须建立在品种确定、质量稳定的基础上，因此，中药鉴定是确定品种及控制质量的前提，更可为扩大和寻找药源提供帮助。近年来，生物分类和鉴定的研究热点DNA分子标记技术可以弥补和克服传统中药鉴定方法的一些缺陷和难题，在物种鉴定等方面有广阔的应用前景[19]。DNA条形码(DNA barcoding)是选用标准短的DNA 片段对物种进行快速准确的自动化鉴定和识别[20]。加拿大动物学家Paul Hebert首先提出将DNA条形码技术引进生物的鉴定中[21]。该技术通过比较DNA条形码，从已知物种的参考序列库中查询未知样本进行真核生物的识别和鉴定[22-23]。研究结果表明，从遗传、有效成分、化学含量和生态因子等方面对药用植物的道地性进行研究，可以证明化学成分含量、生长环境因素与内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2，ITS2)序列的遗传距离相关[24]。张晓瑞等[25]实验结果表明，同一种重楼所生长的地理位置越接近，其相对遗传距离就越小，反之则差异越大，得出结论，生长区域环境是重楼遗传变异及进化趋势的主要影响因素。DNA条形码为重楼属药用植物的鉴别开辟了一条新途径，ITS2作为DNA条形码序列能有效区别不同种属重楼，这在实现规范化生产种植操作规程中可用于种质、种源的正确鉴定和筛选，并能起到监控作用[26]。

2 重楼栽培技术研究进展

重楼各种属虽遍布欧亚地区，但传统上只有在我国入药，我国上市药品有多种成药以重楼为原料，仅云南、四川及广东3省的药品生产企业需求量就超过700吨，供需矛盾尖锐[27]。古来已久的重楼繁育方式为种苗繁育，因此，种苗繁育对于中药材野生资源的补充、人工规范化种植及我国中药产业的发展都有着很重要的作用。重楼种子成熟时易剥离且产量大，理论上种子的有性繁殖可以提供大量种苗，但由于重楼种子具有“二次休眠”的生理特性，且出苗率极低，导致大量种子在漫长的休眠期内丧失了生命力[28]。

重楼种子具有胚后熟、生长周期长和对环境要求高的特性，且重楼种子红皮含抑制植物生长的化合物，不利于种子萌发，这些都增加了重楼种植的难度。目前，重楼的种苗繁育方法主要有种子繁殖、根茎切块繁殖和组织培养，重楼种子的休眠机制决定了在实际生产中只能以带顶芽切段繁殖为主[29]。植物的细胞全能性是组织培养技术的基础，也是当下最能快速高效解决重楼无性繁育瓶颈的途径之一[30]。唐荣华[31]在实验中通过选取重楼的花和叶进行组织培养，未能产生愈伤组织，且3个月后全部失去活力；李群等[32]在筛选外植体时发现，重楼茎叶和花蕾都不能诱导出愈伤组织，也不能诱导出小球茎，证明了不同外植体的诱导频率差异很大；杨丽云等[33]将云南重楼的芽作为外植体进行灭菌处理，然后接种到愈伤组织诱导培养基形成了完整的重楼植株；王跃华等[34]通过选取生长状况良好的黑籽重楼根茎，成功进行了重楼愈伤组织的诱导与增殖。本课题组采用高温和低温交替组合结合植物生长调节剂的方法，打破了重楼种子“二次休眠”的生理特性，解决了重楼种子繁殖周期长、萌发率低的问题；采用激素处理重楼根茎的环纹切口技术，实现了重楼根茎的无性快速繁殖等。

目前，我国规范化生产种植基地实际主要使用的种苗繁育方法还是种子与根茎快速繁殖方法，种子繁殖周期较长，一般都直接以根茎繁殖，目前该方法成熟稳定，可以保证种植的重楼经济效益良好。当前重楼的组织培养研究进展较缓慢，由于其自身的组织细胞脱分化能力较低、细胞分裂速度慢，同时在组织培养过程中还存在条件(繁殖体选择、消毒及培养基等)的筛选等限制，使得该技术还未能在实际种植中得到广泛应用，今后仍需加大对重楼组织培养技术的研究力度。

3 重楼的化学成分和药理作用研究进展

重楼根茎呈结节状扁圆柱形，长5～8 cm，宽1.0～3.5 cm，表面黄棕色或灰棕色，外皮脱落处呈白色密具层状突起的粗环纹，粉性，气微，味微苦、麻。我国学者对重楼属植物的化学成分研究，于1962年初次从重楼中分离出甾体皂苷成分开始。此后，随着国内外学者研究的深入，相继报道了甾体皂苷、蜕皮激素及萜类等各类化合物，目前已从重楼根茎中提取出50余种化合物，主要有甾体皂苷、离氨基酸、甾醇、β-蜕皮激素、多糖及黄酮等[35]。将提取化合物进行分离得到多种皂苷，其主要苷元为异螺甾烷醇类的薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元[36]；但不同种属重楼中皂苷含量及比例差异明显，对重楼的14个种及变种的化学成分进行分析得到200多种化合物，其中甾体皂苷121 个、三萜皂苷18个，所有被研究过的种和变种，都分离得到了甾体皂苷[37-39]。重楼中提取出的化合物的活性成分主要为甾体皂苷，占总化合物的80%以上，其中薯蓣皂苷元、偏诺皂苷元为主要苷元[40]。

重楼作为我国常用的传统中药材，一直以根茎入药。目前，针对重楼化学成分的研究主要侧重于其甾体类成分、氨基酸类成分及无机元素等，药理作用体现在止血、抗肿瘤、抗菌、抗炎、大脑和肾保护等[10]。科研人员已证明重楼的水、甲醇和乙醇提取物都具有明显的抗肿瘤作用[41]，在肝癌[42]、肺癌[43]、胃癌[44]、前列腺癌[45]、鼻咽癌[46]和结肠癌[47]等的治疗中均能起到抗肿瘤作用，重楼皂苷还具有抗肺癌转移作用[48]。重楼苦寒降泻，有广谱抗菌作用，在临床上被广泛用于支气管肺炎、尿路感染、口腔感染及痤疮等各种感染性疾病的治疗[49-51]。研究结果证实，重楼水醇提取物对甲型流感病毒和亚洲甲型流感病毒有较强的抑制作用；重楼煎剂对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、脑膜炎双球菌、宋内氏痢疾杆菌、副伤寒杆菌、大肠杆菌及绿脓杆菌均有不同程度的抑制作用；黄芪重楼汤治疗儿童支气管肺炎的研究结果发现，中药具有保护呼吸道黏膜上皮和肺血管内皮细胞、抑制肺炎支原体生长、改善微循环和调节免疫功能等功能[52]；重楼去脂甲醇提取物可使凝血时间明显缩短；采用大鼠温水甩尾实验、痛行为评分法和β-内啡肽、促肾上腺皮质激素的放射免疫分析，发现重楼皂苷可阻断急性吗啡镇痛耐受形成，现有研究结果也已表明重楼有显著的镇静作用，其强度等同于或略强于地西泮[53]。综上可见，重楼药用价值极高，临床应用范围也越来越广泛，市场需求必将巨大，加大对重楼属植物化学成分及药理作用的深入研究有重要价值和意义。

4 重楼质量控制和品质评价

我国上市药品中有46种中成药以重楼为原料，中成药药效是药材中多成分相互作用的结果，仅凭单个或某几种物质化学成分的含量高低难以全面反映药材的质量，质量的不确定性一直是限制中药走向世界的瓶颈。因此，中药质量的标准化是很有必要且迫切需要的，也是中药走向现代化、国际化的出路。随着科学技术的发展，中药质量控制的技术和方法不断发展，中药质量标准也不断丰富，从以前单成分、单指标的质量控制到如今多成分、多指标的质量控制转变。从中药整体而言，建立一种中药特征指纹图谱将能较为全面地反映中药所含化学成分的种类与数量，进而对中药质量进行科学有效的描述和评价。因此，建立重楼的特征图谱鉴别方法，将能更全面、科学地评价重楼的质量。现代仪器分析手段是重楼质量控制的主要手段，目前用于重楼质量控制的主要方法包括色谱法如薄层色谱法[54]、气相色谱法[55]及高效液相色谱法[56]等，还有光谱法(如紫外、红外光谱法等)、核磁共振谱和联用技术(如气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法及高效液相-飞行时间质谱联用技术)等方法[57-59]。

甾体皂苷是重楼药材及其复方制剂质量控制的指标性成分[60]。《中华人民共和国药典：一部》(2015年版)[1]中，已将重楼皂苷Ⅰ(C44H70O16)、重楼皂苷Ⅱ(C51H82O20)、重楼皂苷Ⅵ(C39H62O13)和重楼皂苷Ⅶ(C51H82O21)的总含量作为重楼含量测定的指标成分；其他标准为：水分不得超过12.0%，总灰分不得超过6.0%，酸不溶性灰分不得超过3.0%，含量测定按干燥品计算，4种皂苷总含量不得低于0.60%。但是，目前对重楼的质量评价标准仍缺乏规范统一的工艺技术参数，系统研究不同种类重楼中有效成分含量的影响，对于确定重楼药材质量的优异以保证重楼的临床疗效具有重要意义。随着科技的发展，近年来对重楼药理作用的研究不断深入，重楼的应用范围日益广泛，其临床价值越发重要，因此，制定一套规范、完整的质量控制体系是重楼临床疗效得以保证的基础和前提。

在规模化种植过程中，重点要解决中药规范化、规模化和品牌化等关键技术问题。目前，主要是利用现代分析检测技术，对特色中药材进行质量评价研究。主要内容包括来源、性状、鉴别、检查、浸出物、高效液相色谱含量测定、炮制方法与原理等的全方位研究，促进中药材质量稳定、可控。根据地区特色中药材的生物学特性和基地条件，进行播种或定植方法、密度及耕作技术和病虫害防治(包括利用生物农药防治病虫害)的综合治理研究；对地区特色中药材生长期内的各指标成分积累和含量的动态变化进行研究，确定其最佳采收期；对产地加工、卫生包装及仓储条件进行研究，制定地区特色中药材规范化种植标准操作规程，建立特色中药材优质高效生产模式。

5 结论

综上所述，《中华人民共和国药典》(2015年版)收载的重楼药用品种为七叶一枝花和云南重楼，但在实际用药中，并未严格区分品种，加上各地参照质量标准不一，导致了重楼药材品质良莠不齐。究其根本，是因为重楼品种繁杂，生长周期较长，植物繁殖率低，资源再生较慢，再加上逐年掠夺式采挖造成的生长环境严重破坏，导致重楼野生资源急剧减少，少部地区甚至濒临枯竭。目前使用较广的块茎繁殖虽然相对较快，但易致不同品种混种，药农在采挖野生重楼过程中也没有进行有效区分，无法判断是否为《中华人民共和国药典》(2015年版)中规定的品种，很多药材收购商也不具备鉴别真伪的能力，造成当下我国中药材市场上存在中药品种不纯正、掺假造假等多种现象，影响了中药材的临床疗效和安全。野生重楼生长条件苛刻，生长于较高海拔背阴山地，喜阴湿，在疏松肥沃、土层深厚和排水良好的砂质壤土中生长良好。因此，保护重楼植物资源，加强质量控制和监管，实行重楼的规范化生产种植，是推进重楼药材及其他中药材产业发展的关键。

重楼植物根茎生长缓慢，生长环境对重楼的品质和产量影响较大，重楼次生代谢产物累积规律、影响重楼有效成分含量的因素分析和重楼林下原生态栽培技术规程中众多参数等关键技术亟需解决；此外，在重楼栽培技术推广模式创新和重楼新产品开发等方面仍需继续深入探索和开发。可以通过建立林下基地选择指标体系、基地建设与生物多样性保护、种子与根茎快速繁殖方法、病虫害防治技术、专用肥开发及重楼药材质量评价体系建立等关键技术和进行规范化种植，并推广应用“产学研”发展模式，有利于解决重楼药材的供需矛盾，培育特色的中药种植产业，优化调整山区产业结构，兼顾经济、社会和生态三大效益，实现地区生物医药产业的可持续发展。