艰难梭菌芽孢抑制剂的研究进展

翟 宇， 强翠欣， 赵建宏

作者单位： 河北医科大学第二医院，河北省临床检验中心，石家庄 050000。

艰难梭菌（Clostridioides difficile）是一种专性厌氧、革兰阳性杆菌，是重要的医院感染致病菌。艰难梭菌可以产生毒素，形成芽孢，可引发感染，临床表现可从轻度腹泻至伪膜性结肠炎甚至死亡，病死率可达3%～15%[1]。艰难梭菌芽孢能够抵抗不利的物理、化学和代谢条件[2]，对艰难梭菌存活、传播起重要作用。艰难梭菌感染高复发率的原因可能是因为艰难梭菌以芽孢形式存在于患者的肠道后萌发成营养细胞（vegetative cell）所致[3]。目前，艰难梭菌感染的治疗药物主要是万古霉素、甲硝唑或非达霉素等[4]。虽然抗生素初治有效，但是艰难梭菌感染患者初愈后复发率高达12%～40%[1]，并且首次复发后，再次复发率上升至64%[5]。所以抑制艰难梭菌芽孢的萌发和生长，对于控制艰难梭菌感染、传播和复发非常重要。

1 消毒剂

1.1 过氧化氢

过氧化氢是一种强氧化剂，水溶液俗称双氧水，主要通过氧化细胞壁来杀灭细菌[6]。过氧化氢可以在病房使用，起到加强清洁和消毒的作用。Kenters等[7]对4种当地常用的消毒剂进行比较，通过计算菌落形成单位（colony forming unit，CFU）来测定艰难梭菌芽孢杀灭情况，结果表明含过氧化氢的消毒剂效果最好，对艰难梭菌RT010、027、014型芽孢均有抑制作用，采用过氧化氢湿巾擦拭方法减少量为5.29（95%CI5.04～5.54）log10CFU，而采用过氧化氢喷雾方法减少4.08（95%CI3.83～4.33）log10CFU，擦拭法对于艰难梭菌芽孢杀灭效果更好（P＜0.001）。

1.2 含氯消毒剂

用含氯消毒剂对医院环境表面进行消毒是控制艰难梭菌传播的主要措施[8]，含氯消毒剂主要对微生物的DNA或蛋白质等造成氧化损伤。含氯消毒剂抑制艰难梭菌芽孢的形成，因此可以降低艰难梭菌感染的罹患率。Goda等[9]将弱酸性氯化亚酸水（weakly acidified chlorous acid water，WACAW）和次氯酸钠（NaClO）溶液对杀灭艰难梭菌芽孢的效果进行比较，结果显示游离氯浓度为50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L的WACAW均可在1 min内杀灭艰难梭菌芽孢数超过3.5 log10CFU，而只有当NaClO溶液的游离氯浓度达到200 mg/L时才能达到同样的杀灭效果。因含氯消毒剂主要活性成分游离氯的氧化能力可以被有机物中和，有机物的存在会使NaClO的杀菌活性普遍降低，但是WACAW可经硫代硫酸钠部分中和后恢复到初始水平，使之在有机物质富集环境下相对稳定，因此可能有助于处理被人类排泄物污染的环境表面。

1.3 酸化乙醇

接触过艰难梭菌感染患者的医护人员手套和衣服上有感染艰难梭菌芽孢的风险。Landelle等[10]发现24%接触过艰难梭菌感染患者的医护人员在摘手套后手上会有艰难梭菌芽孢残留。含乙醇的洗手液对去除艰难梭菌芽孢无效，而用肥皂洗手去除艰难梭菌芽孢只是中等效果[11]。Tomas等[12]发现酸化乙醇，即用盐酸调整pH为1.3的70%乙醇，能有效地快速清除医护人员手套上的艰难梭菌芽孢，并且不会腐蚀衣物或引起呼吸道刺激。实验将酸化乙醇与1∶10和1∶100稀释的家用漂白剂（主要成分为NaClO）以及没有调整pH值的70%乙醇进行比较，结果显示酸化乙醇的灭菌效果相当于1∶100稀释的家用漂白剂，消毒前后手套上艰难梭菌数量减少差异有统计学意义（P＜0.05），70%乙醇没有抑制艰难梭菌芽孢的作用。但由于酸化乙醇对衣物没有漂白作用，也没有不良气味刺激呼吸道。所以酸化乙醇比漂白剂和70%乙醇更适合于清除医护人员手套上的艰难梭菌芽孢残 留。

1.4 氯己定

氯己定又名洗必泰，是一种阳离子表面活性剂，对革兰阴性菌、革兰阳性菌、酵母和包膜病毒有抗菌活性[13]，被广泛应用于各种消毒剂和防腐剂中。氯己定是一种膜活性化合物，通过与细胞壁和质膜相关的负电荷相互作用，破坏营养细胞的保护性屏障。氯己定的抗菌活性对完整的休眠芽孢无效[14]，但是通过物理或化学方法来穿透或降解芽孢保护层，使氯己定进入芽孢后就可以发挥其抗菌活性。Nerandzic等[15]实验证明，加热、加入乙醇和升高pH均可提高氯己定对艰难梭菌芽孢的杀灭效果。艰难梭菌芽孢在80℃氯己定中暴露15 min后，实验观察到芽孢完全消除；加入70%乙醇的氯己定可在37℃时将艰难梭菌减少约1 log10CFU的时间从3 h缩短到1 h；将氯己定的pH从4提高到＞9.5，显著提高了氯己定对艰难梭菌芽孢的杀灭作用（P＜0.001）。这些数据表明，改变物理或化学条件可以提高氯己定对艰难梭菌芽孢的杀菌活性。

2 抗菌药物

2.1 非达霉素

非达霉素是2011年批准上市的一种大环内酯类抗生素，临床Ⅲ期试验证明非达霉素在治疗艰难梭菌感染后25 d没有复发，复发率低于万古霉素[16]。有研究证明非达霉素与其主要代谢产物OP-1118能抑制艰难梭菌芽孢形成[16-17]。Babakhani等[17]将亚抑菌浓度的非达霉素加入早期稳定期的菌液中，之后每隔一段时间定量计算菌液中的总菌数和耐热芽孢数，结果表明1/4 MIC的非达霉素及其主要代谢产物OP-1118即能抑制艰难梭菌芽孢形成，而相似亚抑菌浓度的万古霉素、甲硝唑和利福平均不能抑制艰难梭菌芽孢形成。除抑制芽孢形成外，抑制艰难梭菌芽孢转化为营养细胞，也是防止艰难梭菌感染复发的有效途径。Allen等[18]研究表明虽然非达霉素并不会影响艰难梭菌芽孢的萌发，但可以抑制艰难梭菌芽孢萌发后营养细胞的生长从而减少艰难梭菌感染的复发和传播[19]。

2.2 奥利万星

奥利万星是一种新型的半合成脂糖肽，具有良好的抗菌活性[20]。有报道称，奥利万星在体外肠道模型中对模拟艰难梭菌感染的治疗非常有效，并且没有诱导艰难梭菌感染的倾向[21-22]。虽然奥利万星对艰难梭菌芽孢萌发没有作用，但是可以减慢芽孢生长速度。Chilton等[23]用相差显微镜观察4株艰难梭菌（分别为核糖体027、001、106、078型）在不同抗生素作用下折光性强、相对明亮（phase-bright）的芽孢，折光性弱、相对较暗（phase-dark）的芽孢和营养细胞的数量变化，结果表明，暴露于万古霉素、甲硝唑和奥利万星的芽孢从相对明亮转变为相对较暗的速率与空白对照组相同， 24 h后万古霉素和甲硝唑处理的芽孢从相对较暗生长为营养细胞的数量与空白对照组相当，80%芽孢生长为营养细胞；而奥利万星处理的芽孢仅有20%从相对较暗生长为营养细胞。结果表明奥利万星在亚抑菌浓度水平可以抑制芽孢由相对较暗向营养细胞的转变，但不能抑制艰难梭菌芽孢由相对明亮转变为相对较暗。

2.3 雷莫拉宁

雷莫拉宁是一种糖肽类抗生素，其作用机制是阻止细胞壁肽聚糖生物合成，对需氧和厌氧革兰阳性菌包括对万古霉素耐药的肠球菌都有抗菌活性。Kraus等[24]通过体外模型实验表明雷莫拉宁可以结合艰难梭菌芽孢，并且可以高效率地杀死艰难梭菌营养细胞。Freeman等[25]通过动物实验证明雷莫拉宁在减少艰难梭菌芽孢形成和释放方面优于万古霉素，雷莫拉宁治疗组盲肠内容物内仍有艰难梭菌芽孢的小鼠数量（6/23）比用万古霉素治疗组（19/23）少（P＜0.05）。

2.4 卡达唑胺

2.5 Ridinilazole

Ridinilazole前身为SMT19969，是一种新型的窄谱合成抗菌药物。这一类新型杂环类抗菌药物的作用机制尚未完全阐明，但目前已知ridinilazole可抑制细菌DNA合成[31-32]。此外，Bassères等[33]研究表明，与其他传统的抗生素相比，ridinilazole可诱导艰难梭菌菌体延长、抑制分裂及芽孢形成。

2.6 Surotomycin

Surotomycin以前称为CB-183315，是一种窄谱环脂肽类抗生素，适应证为艰难梭菌相关性腹泻[34]。Aldape等[35]用surotomycin对3株艰难梭菌毒素产生和芽孢形成情况进行实验，结果表明低浓度surotomycin [约（1～2）×10-3mg/L]可以抑制艰难梭菌毒素产生，同时剂量依赖性地减少了3株艰难梭菌芽孢的形成，这些结果有利于surotomycin用于艰难梭菌感染治疗的新药开发。

2.7 CRS3123

CRS3123前身为REP3123，是一种最近开发的全合成二芳基二胺抗菌药物[36]，通过抑制细菌蛋白合成来抑制艰难梭菌生长和芽孢产生[37]。Ochsner等[38]在固体培养基上比较REP3123、万古霉素和甲硝唑对艰难梭菌芽孢形成的作用。亚抑菌浓度下不同抗菌药物处理后，艰难梭菌芽孢形成有不同变化。1/2 MIC和1/4 MIC浓度REP3123处理后所有菌株芽孢产量均有所下降；3株艰难梭菌在亚抑菌浓度甲硝唑处理后，芽孢产量显著增加；2株艰难梭菌在亚抑菌浓度万古霉素处理后，芽孢产量显著增加。

3 益生菌与益生元

肠道菌群的不同代谢产物可干扰艰难梭菌感染的发病，阻止艰难梭菌芽孢的萌发。对于艰难梭菌感染特别是复发性艰难梭菌感染，替代疗法建议以粪便移植的形式应用肠道益生菌，以纠正肠道菌群失调[39]。Rätsep等[40]实验证明艰难梭菌的存在不影响植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的生长，但植物乳杆菌可以影响艰难梭菌的生长。将艰难梭菌与植物乳杆菌共同培养24 h后，15株艰难梭菌中有13株计数降至0；同时，在植物乳杆菌预孵育的BHI培养基中，艰难梭菌芽孢萌发延迟24 h，但在植物乳杆菌和木糖醇共同预孵育的BHI培养基中，48 h内完全抑制了艰难梭菌芽孢的萌发。木糖醇和植物乳杆菌共同作用可抑制艰难梭菌芽孢萌发和营养细胞形成，减少艰难梭菌在肠道内定植，为日后预防艰难梭菌感染及防止复发提供新的思路。

4 胆汁酸

4.1 次级胆汁酸

人体肝脏中的初级胆汁酸进入肠道在细菌的作用下与牛磺酸或甘氨酸结合形成次级胆汁酸[41]。牛磺胆酸（TCA）可以刺激艰难梭菌芽孢萌发，而鹅脱氧胆酸（CDCA）是TCA介导的艰难梭菌芽孢萌发过程的拮抗剂，0.04% CDCA即可抑制艰难梭菌芽孢萌发[42]。人体肠道内大约有50种次级胆汁酸，小鼠体内有2种人体中不存在的胆汁酸，即α-鼠胆酸（AMA）和β-鼠胆酸（BMA）。ω- 鼠胆酸（OMA） 是由正常菌群产生的BMA异构体。Thanissery等[43]对常见的次级胆汁酸，如脱氧胆酸（DCA）、石胆酸（LCA）、熊脱氧胆酸（UDCA）、脱氧胆酸羟化物（iDCA）、石胆酸羟化物（iLCA）、OMA和猪脱氧胆酸（HDCA）在艰难梭菌芽孢萌发、生长和毒素产生方面进行体外试验。结果显示0.2% DCA和0.1% iLCA即可有效抑制实验所用的7株不同型别的艰难梭菌芽孢萌发，其他5种次级胆汁酸至少抑制了5株艰难梭菌芽孢萌发。Francis等[44]针对不同浓度鼠胆酸对艰难梭菌芽孢萌发影响情况进行比较，结果表明3种鼠胆酸均能在体外抑制艰难梭菌芽孢萌发，并且BMA比AMA更有效。由于次级胆汁酸可以改变艰难梭菌的生长周期，这意味着未来次级胆汁酸可以成为潜在的艰难梭菌感染治疗方法，但目前还需要在机制方面深入研究。

4.2 胆汁酸衍生物

人体中CDCA抑制艰难梭菌芽孢的萌发，但是抗生素会使胆汁酸代谢紊乱而影响CDCA的释放；另一种抑制艰难梭菌芽孢萌发的内源性胆汁酸UDCA，由于必须从回肠重吸收到肠肝循环中，不能在结肠内达到抑制艰难梭菌芽孢所需的浓度。Stoltz等[45]对CDCA和UDCA进行化学修饰，用核糖体027型艰难梭菌对合成的化合物进行筛选，结果表明UDCA的C24酰胺或四唑衍生物是最有效的化合物，此外C3的取代物耐受良好，而C7的取代物通常会降低化合物的抑制活性。Howerton等[46]发现一种胆酸甲苯磺酸衍生物CamSA能够抑制艰难梭菌芽孢在小鼠体内萌发。研究者用大量的艰难梭菌芽孢感染小鼠，之后给予小鼠不同浓度的CamSA并监测症状，同时对粪便中艰难梭菌芽孢和营养细胞进行计数。结果发现在没有观察到药物毒性的情况下，50 mg/ kg CamSA可以避免感染艰难梭菌芽孢的小鼠发展为艰难梭菌感染，但是无法避免感染艰难梭菌营养细胞的小鼠发展为艰难梭菌感染。较低剂量的CamSA可延缓艰难梭菌感染发作并减轻症状。CamSA可以通过抑制艰难梭菌芽孢萌发为营养细胞，从而抑制艰难梭菌感 染。

5 天然产物及其提取物

5.1 香芹酚

香芹酚是一种单萜类苯酚，来源于植物的食品级化合物，有抗菌和抗炎的功效。体外试验表明，香芹酚能有效地抑制艰难梭菌产生毒素，而不影响人类正常胃肠道菌群[47]。Mooyottu等[48]继续就香芹酚对艰难梭菌芽孢产生、萌发和生长等方面进行试验。研究者将亚抑菌浓度的香芹酚加入到含艰难梭菌的肉汤中，之后对艰难梭菌营养细胞和芽孢进行计数，结果显示香芹酚对艰难梭菌营养细胞数量没有影响，48 h、72 h、96 h的艰难梭菌芽孢产生量比对照组显著减少，证明香芹酚可以抑制艰难梭菌芽孢产生；同时对艰难梭菌芽孢萌发生长曲线进行监测，结果显示亚抑菌浓度的香芹酚可以减少艰难梭菌芽孢生长成营养细胞，而最低抑菌浓度的香芹酚可以完全抑制艰难梭菌芽孢生长成营养细胞；同时研究者发现香芹酚显著下调了艰难梭菌芽孢相关基因表达，如spo0A、spo IIR、spoIIID、sigH和CD2492。

5.2 Rhodomyrtone

Rhodomyrtone是一种来自玫瑰桃金娘草叶子的天然小分子物质，对革兰阳性菌具有强大的杀菌活性，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和产芽孢的枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌[49]。Srisuwan等[50]对比了rhodomyrtone和万古霉素对艰难梭菌芽孢生长的作用。结果表明rhodomyrtone和万古霉素抑制艰难梭菌芽孢生长的浓度分别为0.625 mg/L和2.5 mg/L。Rhodomyrtone对艰难梭菌芽孢生长为营养细胞的抑制作用是万古霉素的4倍。

6 纳米材料

如今，纳米材料在医学中的应用越来越多，一些有显著抗微生物活性纳米材料如银、氧化锌和氧化钛纳米颗粒已被用作替代杀菌剂。抗菌机制可能与产生活性氧、破坏细胞膜、结合硫醇基团以及释放有毒离子等有关[51]。含铁颗粒通常被认为是具有高度生物相容性的纳米材料。最近报道一些特定的氧化铁纳米颗粒具有抗菌活性[52]。Lee等[53]评估Fe3-δO4纳米颗粒能否抑制体内艰难梭菌芽孢萌发。将艰难梭菌芽孢在0.5 µg/L Fe3-δO4中处理20 min，有64%不能萌发为营养细胞。Fe3-δO4通过与芽孢表面蛋白结合，减少芽孢释放吡啶二羧酸（DPA）从而抑制艰难梭菌芽孢萌发。在艰难梭菌感染动物模型中，用Fe3-δO4处理过的艰难梭菌芽孢感染小鼠，小鼠结肠炎发病率下降为原来的1/3，并且Fe3-δO4对小鼠肠道菌群没有影响。

随着艰难梭菌感染发病率的增加和高产毒株027/NAP1/BI的暴发流行，艰难梭菌感染成为世界范围内不断增长的公共健康问题[54]。艰难梭菌在医院和疗养院中的高度传播与环境中具有大量高抵抗力的芽孢有关[55]。尽管毒素是导致艰难梭菌感染的主要致病因素，但艰难梭菌芽孢形成、萌发和生长为营养细胞是艰难梭菌感染传播和复发的重要因素。复发是艰难梭菌感染的主要问题，有20%～30%患者有至少一次复发的经历[56]。所以，选用合理有效的消毒剂和药物是阻止艰难梭菌芽孢传播和抑制芽孢复发的重要措施。