有机化学实验中使用HPLC法测定4种茶中的咖啡因

张艳虎，周琢强

（华南农业大学材料与能源学院，广东广州 510642）

茶树的叶子在嫩绿的时候进行加工就制成了茶叶，茶叶有多种多样，且有很多品牌，通常有红、绿、黑、花茶，饮茶具有明目清神的效果，对身体非常有益，有非常明显的保健作用。茶叶含有大量嘌呤类生物碱，主要由咖啡因组成，一般含量都能达到2%～5%。咖啡因（CAF）是一种弱碱性生物碱，脂溶性强，与强光以及高温下不具有稳定性，能够溶在沸腾的水中、丙酮、乙酸乙酯、乙醇，非常容易溶解在二氯甲烷当中。中枢神经受到咖啡因刺激会变得非常兴奋：达到增强大脑皮层兴奋需要达到中低剂量（80～400 mg），降低疲劳，提神醒目，当剂量达到（≥500 mg）就能够使兴奋延脑血管运动中枢以及呼吸中枢，咖啡不仅能够，在饮品、食品、日用化工等方面应用，同时在医药卫生方面的运用也非常广泛。咖啡因的提取方式不仅可用有机合成法也可以用系统提取法。1820年，Runge第一次在可可豆和茶叶中取得，1950年中国在茶叶中取得；在1895年，Fischer运用化学合成了咖啡因，1958年，中国合成之后进行了生产。因为它们之间的晶型不一样、精制方式也不一样，所以，咖啡因粉的X-射线也不一样。但升华可使合成品转晶。运用有机化学试验当中溶剂法取得（索氏提取，浓度为95%的乙醇），在用升华法纯化即可取得。检测茶叶中咖啡因剂量的方法较多，例如容量分析法、薄层色谱法、气相色谱法、紫外分光光度法、高效毛细管电泳法、高效液相色谱法等。此研究依据国标GB/T 8312—2002中HPLC法对茶叶中咖啡因含量进行检测，在有机化学实验当中用茶叶检测含量，同时对同学们从茶叶里取得咖啡因的数据结果予以评价。

1 设备和化学试剂

1.1 设备

数字熔点测定仪（申光牌WRS-1A），电热恒温水浴锅（型号：HWS-12），可调试电砂浴（型号：DK-2），精密电子天平（厂家：北京赛多利斯 型号：BSll0S），索氏提取器，红外分光光度计（型号：岛津IR-prestige-21），仪器高效液相色谱仪（双波长紫外检测器，岛津LC-2010 AHT）。

1.2 试药

咖啡因对比品（自己制造的熔点测定仪进行熔点测定234.27～235.67℃），甲醇（色谱纯），茶叶（绿茶 1、红茶和砖茶、绿茶 2、）（市场销售），纯净水，乙醇（纯度为95%）。

2 方式与效果

2.1 咖啡因的取得

称量茶叶重量10g，放在研钵里予以研碎，然后放在索氏提取器里，用75 ml浓度为95%的乙醇获取，放在水中进行加热，持续提取时间大概为1.5h，最后浓缩到20ml。加入化学试剂氧化钙3～4g，之后用水蒸气予以蒸干之后，将准备好的玻璃漏斗倒放在蒸发皿之上，但中间必须用带小孔的滤纸予以隔离，以防出现升华现象，然后加热至200-230℃，升华进行完以后，将其冷却到100℃，将白色针状结晶进行收集，进行称量，最后测熔点。

2.2 咖啡因对比品的制备

取适量纯度不高的咖啡因，置于蒸发皿当中进行更近一步的升华纯化，测量其熔点，取适量咖啡因利用溴化钾压片测其红外光谱。纯化后的咖啡因熔点为234.27～235.67℃，和国家药典文献描述统一，数据库对红外光谱进行检索后与咖啡因图谱统一。

2.3 咖啡因比例的检测

2.3.1 色谱的条件

流速：1ml/min，检测波长：280nm，柱温：40℃，色谱柱：Inertsil ODS-SP柱（规格 4.6 mmX150 mm，5μm），进样量：10μm，流动相：水一甲醇（比例为 65：35）.

2.3.2 制备对照样品溶液

准确称量12.5mg咖啡因对照样品，放在25ml容量瓶内，加乙醇一水（配比为 1：4）定容到刻度（500μg/m1），以备使用。

2.3.3 描画制作标准曲线

仔细吸取对比样品液体（500/μg/m1）1.5、1.2、0.9、0.6、0.3ml，均放在10ml容量瓶当中，然后加入纯净水到定容刻度，浓度分别为75、45、60、30、15μg/ml对比样品溶液，然后用0.45μm微孔滤膜进行过滤。根据以上色谱要求进样10μl，纵坐标用峰面积A表示，横坐标代表标准咖啡因浓度C，进行描绘制作标准曲线。只要浓度在15～75μg/ml内，咖啡因和峰面积呈线性关系，相关系数y=O.9999，标准曲线方程A=24137C+35952.

2.3.4 回收率试验

准确称量8份（每份2.0g）茶叶（绿茶1）样品，在当中的6份里各放进两份高（45mg）、中（25mg）、低（10 mg）3种不一样剂量的对比样品，其中的2份作为本底值，根据样品溶液取得办法制备并且加入标准样品溶液，根据样本的检测方法予以检测。回收率的计算结果是91.90%-100.03%。

2.3.5 精确度实验

准确吸取0.9ml对照品溶液，放在10ml容量瓶当中，然后加水进行稀释直到规定刻度，浓度是45μl/ml，两小时进一次样，共需要测量五次。每天精密度计算结果为0.042%。

2.3.6 样本测量和对比实验结果

称量四种茶叶的重量各10g，然后放在研钵里予以研碎，再将其放入索氏提取器当中，在其中加入浓度为95%的乙醇75 ml，放在95℃水中进行加热，提取时间需要持续大概1.5h，浓缩以后放在100ml容量瓶里加水定容，准确吸取1.0ml，用水定容至刻度在5ml的棕色量瓶中，0.45μm微孔滤膜进行过滤然后进样，最后测定结果。

3 探讨

同学们进行的试验当中提取率最高的分别是红茶、绿茶2，最低的是砖茶，HPLC检测结果与其统一。不过收率都不高，通过研究发现造成收率低的因数有两个。第一是因为同学们试验时在升华时没有将温度控制好，结晶不能全部予以收集；第二是砖茶研磨的不够到位，因为砖茶的枝叶比较硬，也是导致提取率偏低的因素；最后在1.5提取时虹吸次数的不稳定也会造成提取率不高。同学们的实验结果和HPLC结果进行对比，两者的提取率都大于10%，红外光谱检测与收集在一起的咖啡因通过熔点检测获得的产物纯度比较高，证明咖啡因通过有机溶剂在茶叶中提取的办法比较成熟。

此研究依据国家标准GB/T8312—2002当中利用HPLC法检测茶叶中所含咖啡剂量的方法，根据国准给出的色谱要求，流动相：水-甲醇（配比为 70：30），柱温：40℃，流速：1ml/min，进样量：10μl，检测波长：280nm，测得结果是其它物质峰比较多的存在于绿茶2、绿茶1当中，很难完全和咖啡因峰区别开，依据高效液相色谱道理将流动相极性增大，通过数次试验把流动相改成：水-甲醇（比例为65：35），其他条件不做改变，从而将咖啡因峰和其他物质峰进行分离在从4种茶叶里获取样品溶液的过程当中。在测定HPLC时，绿茶2、绿茶1都含有比较多的其它物质峰，但红茶与砖茶就比较少。依据调查研究得出因为工艺以及原料的差异导致茶叶中成分存在不一样的地方。茶树新梢作为绿茶的原材料，通过反复搓擦、杀青（经过高温予以破坏以及对新鲜叶子当中的氧化酶活性进行钝化）、使茶叶失去水分等工艺制做而成，由于通过氧化酶灭活以后，茶叶的很多成分能够保留在炮制过程当中，会产生紫外吸收当在280nm的紫外检测波长之下，会出现很多物质峰。茶树上面的新芽叶作为红茶的原材料，通过发酵干燥等制作而形成，让茶叶在炮制时全面氧化分解代谢，降低了产生的紫外吸收在280nm紫外检测波长之下，就会表现出相对偏低的物质峰。