沙门氏菌检测的研究进展

郭耀东，韩晓江，张英华，岳田利

（1.商洛学院健康管理学院，陕西商洛 726000；2.商洛市产品质量监督检验所，陕西商洛 726000；3.西北大学食品科学与工程学院，陕西西安 710069）

沙门氏菌最早在1885年被发现，在自然界中分布较为广泛，可引起动物和人体患有疾病，具有传播性。每年超过3 000万人感染沙门氏菌，引起死亡20多万人。作为革兰氏阴性菌的一种，菌群种类较多，在猪肉、鸡肉、海产品等食物中都可受到沙门氏菌的污染，如果被人摄食，进而导致人体疾病的发生。近10年间，由沙门氏菌引发的中毒事件达到166起，累计发病近9 000人，主要由肠炎沙门氏菌菌群所引起，而沙门氏菌中毒事件主要发生在夏秋季节，天气炎热，菌群生长繁殖较快，更多由交叉污染或者加工不当引起。因此，能够快速检测食品中的沙门氏菌对人类公共安全和食品安全都具有重要意义。

1 检测方法

目前，利用国标法检测食品中沙门氏菌是标准检测方法，但操作复杂、耗时太久，影响事件结果，随着科技的发展和分子生物学的兴起，各种先进技术用于沙门氏菌的检测。

1.1 PCR技术检测

武晓松等人[1]对蔬菜中沙门氏菌建立了一种快速检测的PCR方法。其根据特异基因设计引物并对其进行PCR扩增，根据沙门氏菌不同浓度菌悬液产物与平板菌落数的对应线性关系确定沙门氏菌的检出限。研究发现，沙门氏菌稳定特异性基因为invA基因，对沙门氏菌检出限为1 550 CFU/mL，对香菜的检出限为63 CFU/g。研究建立的沙门氏菌PCR检测方法可用于检测蔬菜中沙门氏菌的污染状况。Erik E等人[2]利用PCR技术检测粪便中的沙门氏菌，总共测试了391个样本，该方法的灵敏度为0.88，并且在100个非种子样品中没有获得假阳性结果。在PCR分析之前没有进行DNA提取，方法非常简单。总体结果清楚地表明，包括所有动物物种和所有血清型的粪便，MSR表现最佳，其中一个计算精度为99%，计算灵敏度为98%。该方法与各种商业ELISA方法和NMKL方法比较，检测的灵敏度密切依赖于研究起源使用的粪便和要检测的沙门氏菌菌株。此方法筛选成本非常低，如果在Selekta富集中的孵育时间延长，该方法可进一步提高其灵敏度。Whyte P等人[3]研究原始肉鸡屠体中沙门氏菌的流行情况并对其进行了一项调查，在商业肉鸡屠宰设施的40个鸡群中共获得198个颈部皮肤样品。通过传统培养方法和沙门氏菌特异性聚合酶链反应（PCR）测试评估沙门氏菌的存在。使用传统培养方法从所有样品中的32个（16%） 回收沙门氏菌。相比之下，PCR测定证明更敏感，并且在38个（19%） 测试样品中检测到沙门氏菌DNA。当组合培养和PCR结果时，在198个样品中的45个（23%）中检测到病原体。当检测到鸡群中的沙门氏菌时，PCR检测的灵敏度也大于培养物（通过PCR检测53%的鸡群，通过培养检测30%的鸡群）。2项测试的结合显示，55%的鸡群被沙门氏菌感染。PCR检测证明是检测沙门氏菌的高度特异性和灵敏的方法，并且结合标准培养和常规PCR检测可以有效地提供肉鸡胴体中该病原体流行的更准确的概况。

尽管定量聚合酶链反应（qPCR）导致了微生物检测的进步，但由于PCR抑制剂的存在，复杂的环境样品（如沉淀物）仍然是一个挑战。水生沉积物积聚颗粒结合的微生物污染物，从而反映累积的微生物负荷随时间的变化。相对较新的液滴数字PCR（ddPCR）已成为一种直接定量方法，对PCR抑制剂具有高度耐受性，并放弃了校准/标准曲线的必要性。Singh G等人[4]研究比较了ddPCR与qPCR在南非德班非正式定居点附近的Palmiet和沉积物中沙门氏菌的定量分析。与qPCR相比，ddPCR显着提高了分析灵敏度和低浓度沙门氏菌的检测。从qPCR和ddPCR测量的预期拷贝数显示出良好的R2值（分别为0.999和0.994）。主要受非正规定居点影响的部位在qPCR和 ddPCR中分别表现出 255±37和818±30沙门氏菌/g（p＜0.000 1） 的沙门氏菌。用ddPCR改进沉积物中沙门氏菌的检测，使其成为多种环境样品中沙门氏菌定量的有前途的技术方法。

1.2 基因芯片技术

基因芯片技术是分子生物学与计算机应用的一种融合，是指DNA片段经过CR扩增之后，基于核酸杂交原理，将这些基因序列标记为未知靶基因序列，将其与集合了大量已知序列探针的基因芯片上特定的基因位点上的探针进行杂交，再通过检测杂交信号来对基因信息进行分析。一次可对大量核酸分子进行检测分析，弥补了PCR免疫杂交等只限于检测一种或少数几种靶标微生物或基因。

陈昱等人[5]利用多重PCR和基因芯片技术检测和鉴定沙门氏菌，选取编码沙门氏菌肠毒素（stn）基因设计引物和探针，进行三重PCR扩增，产物与含特异性探针的芯片杂交。对7种细菌共26株菌进行芯片检测，仅3种菌得到阳性扩增结果，证明该方法具有很高的特异性。对模拟食品样品进行直接检测，结果与常规细菌学培养结果一致，检测限为50 CFU/mL。沙门氏菌基因组DNA和细菌纯培养物的检测灵敏度约为8pg。McquistonJR等人[6]开发了一种基于沙门氏菌DNA的测定，利用其靶向编码Kauffmann-White血清分型鞭毛抗原（fliC和fljB）的基因。研究结果表明，在测定中检测到的36种抗原正确鉴定了461种（92.2%） 分离物。在被认为正确鉴定的分离株中，47个（9.4%） 是部分血清型。未正确鉴定的39种（7.8%）菌株具有应该通过测定检测到但未检测到的抗原。分子检测结果与传统方法相比具有更高的通量，同时保持了Kauffmann-White血清分型方案的完整性。张蓓蕾[7]利用糖芯片技术快速检测沙门氏菌，制作不同类型的糖芯片用于优化糖芯片检测条件，通过降低糖浓度或细菌浓度确定糖芯片检测限值，研究了糖芯片在沙门氏菌和凝集素FimH拮抗剂筛选上的应用。研究结果表明，沙门氏菌可与甘露糖化合物修饰的糖芯片结合，其中，以Man-1与NHS玻片所构建的糖芯片效果最优，并且2种不同的沙门氏菌（ATCC31685和ATCC9184）与糖芯片的结合能力不同，因此糖芯片可作为沙门氏菌的一种快速检测手段，在糖浓度为313 mmol/L或细菌浓度1×106CFU/mL时荧光信号接近背景值。

1.3 免疫磁珠检测沙门氏菌

免疫分析检测技术是在免疫学理论基础上，利用抗原-抗体反应的特异性，免疫放大技术来鉴别细菌。建立的沙门氏菌免疫学检测方法大致可分为酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫磁珠分离技术、免疫荧光法，在此基础上还可以利用乳胶凝集、免疫传感器、免疫扩散、免疫印迹及免疫色谱技术等方法检测沙门氏菌。

Hyeon J Y等人[8]首次尝试将免疫磁性分离（IMS），通过多重置换扩增（MDA） 的全基因组扩增和实时PCR结合用于检测食物样品中的细菌病原体。该方法可有效实现原始鸡胸中低水平肠道肠炎沙门氏菌（SE） （6 510 CFU/g） 的实时PCR检测，无需培养富集。此外，在4 h培养富集后，能够检测到生鸡胸中较低浓度（650.1 CFU/g）的冷藏应激SE细胞，将检测过程从数天缩短至数小时，检测率无显著差异与基于培养的检测方法相比。与传统的实时PCR相比，通过显着提高SE检测的性能，证明了IMS-MDA实时PCR作为检测食品中沙门氏菌的快速、灵敏且经济方法的潜力。

沙门氏菌大约有2 400种血清型，然而95%引起沙门氏菌病的菌株是属于血清群A±E的40种血清型。常规的预浓缩肉汤，选择性浓缩肉汤和浓缩液差异琼脂需要72±96 h才能实现沙门氏菌的假定鉴定。然而，免疫磁分离（IMS） 取代了24 h选择性富集使用顺磁颗粒进行10 min免疫捕获程序。然而，该程序需要在选择性培养基上过夜培养作为终点检测点。因此，结合通过IMS选择性固定靶细胞和第二检测抗体的基于ELISA的末端检测方法将是非常有利的。Mansfield L P等人[9]将IMS技术与基于ELISA的程序结合使用沙门氏菌属特异性单克隆抗体M105。该抗体特异于沙门氏菌脂多糖的外核心区域，因此，它与沙门氏菌Ra粗突变体的LPS上的表位结合，而不与Rc或Re沙门氏菌粗突变体的LPS结合。Zhang S等人[10]制备了沙门氏菌特异性抗体，并建立快速检测肉制品中沙门氏菌的ELISA系统。研究用6种致病性沙门氏菌制备的抗原免疫BALB/c小鼠和兔；用杂交瘤技术进行细胞融合。结果表明，获得了1株杂交瘤（6E7CGMCC10313）稳定分泌单克隆抗体（M23） 和多克隆抗体（P23）。制备的高纯度抗体滴度为1∶1.28×106和1∶8.0。P23作为包被抗体吸附在96孔微量滴定板上，用辣根过氧化物酶标记M23。建立夹心ELISA检测肉样品污染。LOD为800 CFU/g。该ELISA系统灵敏度高，具有良好特异性，研究适用于肉类定性和半定量快速检测沙门氏菌。

1.4 免疫荧光检测

免疫荧光检测是将免疫学检测方法与荧光标记技术相结合，具体操作是先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体（抗原），再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原。Pandey S K等人[11]研究了一种新的夹心型荧光免疫分析格式，使用多黏菌素B，一种阳离子受体分子，作为黏合剂，而抗Vi抗体作为特异性检测沙门氏菌血清型伤寒沙门氏菌的捕获剂。针对Vi-BSA缀合物产生的抗ViIgG抗体显示出7.779 nM-1的亲和力，表示Vi多糖中O-乙酰基的免疫显性。所开发测定的检测限为约101细胞mL-1的Vi表达肠炎沙门氏菌血清型Typhi，相关系数（R2）等于0.97。对于所有测试的血清型Typhi临床分离株以及加标血液样品的病原体获得的阳性反应推荐Vi抗原作为伤寒期间的生物标志物的特异性和准确性。Vi加标样品的批内和批间精密度均令人满意，显示方差系数（CV%），平均值分别为4.05%和5.97%。

1.5 传感技术检测鉴定

以传统方法为基础，金属有机骨架材料是由金属离子或金属簇和有机配体通过自组装而形成的一类新型纳微结构功能材料，制备荧光生物传感器。利用核酸适配体的高亲和力与高特异性识别能力，可快速、准确可靠、灵敏、特异性高检测沙门氏菌。目前，用于沙门氏菌检测的传感器包括酶传感器、免疫传感器、电化学生物传感器、基因传感器和光敏传感器等。

蒋晓华等人[12]基于金属有机骨架材料的荧光猝灭特性以及对核酸适配体的吸附性，结合核酸适配体的高亲和力与高特异性识别能力，构建了针对沙门氏菌检测的荧光生物传感器。利用金属有机骨架材料-核酸适配体荧光法检测沙门氏菌。研究结果表明，构建的荧光传感器的信号与沙门氏菌浓度的对数在1×101～1×105CFU/mL范围内呈良好的线性关系，检出限（S/N=3） 为7 CFU/mL，将该方法用于虾肉样品中沙门氏菌的检测，加标回收率为90.0%～108.0%，该传感器对沙门氏菌有较好的选择性与灵敏度。Fei J等人[13]将电化学免疫传感器用于鸡伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌的快速检测。通过制备的传感器用于捕获抗体、提高信号强度的金纳米粒子的电沉积。捕获结果表明对鸡伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌的检测限均为3×103CFU/mL。该研究中提供的电化学免疫传感器敏感性高、特异性强，且重复性好的沙门氏菌检测方法。

1.6 其他技术检测沙门氏菌

为了弥补单一检测技术的不足，研究者们将各种检测技术，如光谱技术、电化学技术、纳米技术、传感技术、电子显微技术和以微生物代谢为基础的阻抗法等相互结合，为检测和鉴定致病性沙门氏菌带来了新契机。高分辨熔解曲线检测是在PCR扩增之后，利用扩增产物的差别，它们产生的熔解曲线也会发生变化，通过识别熔解曲线的变化来区分产物，核酸序列的遗传差异，进而凭借熔解曲线数据对来源不同的沙门氏菌进行分类和分型。

Zeinzinger J等人[14]基于fljB，gyrB和ycfQ片段中的特定单核苷酸多态性，开发了三重基因扫描测定法并评估了肠道沙门氏菌分离株的血清型特异性亚型分析。通过对含有46种不同血清型的417株沙门氏菌分离株进行高分辨率熔解曲线分析，同时对fljB，gyrB和ycfQ进行基因扫描，可以对37种血清型进行明确、简便、快速的鉴定。开发的闭管三重高分辨率熔解曲线测定结合肠炎沙门氏菌特异性PCR，代表了一种改进的方案，用于准确、经济、简单、快速地分型39种沙门氏菌血清型。

Fei Jia等人[15]将纳米技术、电子显微技术及电化学阻抗谱等技术于一体，将氧化还原石墨烯的纳米复合材料 （rGO） 和羧基改性的多壁碳纳米管（MWCNTs）直接固定在玻碳电极表面，利用沙门氏菌的氨基修饰的特异性核酸适配体与rGO-MWCNT通过酰胺键共价结合。通过透射电子显微镜和扫描电子显微镜来观察描述rGOMWCNT的形态，利用电化学阻抗谱监测。研究结果表明，此装置可实现沙门氏菌的量化检测，检测范围75～7.5×105CFU/mL，检测限为25 CFU/mL，检测时间为1 h。

2 结语

沙门氏菌病对动物及人体都会造成一定的病菌感染，应对其防治加以重视。随着人们对沙门氏菌关注度的提高，沙门氏菌检测及鉴定也得到了不断发展，利用传统方法，诸如分子生物学检测、生化检测、免疫学检测。耗时较长、操作过程复杂，不能及时给出食品安全性评价。现代分子生物学检测虽然快速、准确、灵敏、特异性较强，但对设备、技术人员、环境要求较高，难以推广普及。每一种检测技术都有一定的优缺点，目前有较多新型的沙门氏菌检测方法，应对检测方法进行交叉使用，各取其优点。