中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白在银屑病患儿血清中的表达及致病机制研究

钱革 郭武 尹兴平 季江 刘涛 吴剑波 钟连生河南省儿童医院皮肤科，郑州 0000；无锡市第三人民医院皮肤科 000；苏州大学第二附属医院皮肤科 000；空军军医大学唐都医院皮肤科，西安 700；武汉大学中南医院皮肤科 0000；徐州医科大学附属医院皮肤科 000

银屑病是由Th1/Th17紊乱介导的以表皮角质形成细胞过度增殖和分化异常为特点的慢性炎症性疾病，皮损部位伴中性粒细胞聚集。中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL）是一种主要在中性粒细胞中表达的糖蛋白，最先在中性粒细胞的特殊颗粒中发现［1］。目前已经明确，NGAL在炎症性、损伤性及肿瘤性疾病的发生发展中发挥重要作用。儿童银屑病与感染、炎症关系紧密［2］。本研究中我们观察NGAL在儿童银屑病中的表达情况，同时利用人永生化角质形成细胞株HaCaT，研究NGAL对表皮细胞分泌细胞因子的影响。

对象与方法

一、对象

2017年1月1日至2018年12月31日在河南省儿童医院皮肤科、徐州医科大学附属医院皮肤科、武汉大学中南医院皮肤科、苏州大学第二附属医院皮肤科、空军军医大学唐都医院皮肤科和无锡市第三人民医院皮肤科确诊为新发的寻常型银屑病患儿98例。其中男51例，女47例，年龄3～14（7.00±2.99）岁，病程 3～28（7.4± 5.85）d；其中 34例（34.7%）伴发热，65例（66.3%）有咽部红肿或者扁桃体肿大；43例为急性点滴状银屑病。98例患儿均无其他严重内脏疾病，无过敏性疾病史，就诊前1周内未用任何药物治疗银屑病。本研究通过河南省儿童医院医学伦理委员会批准（2016-K-031），患儿家长均签署知情同意书。所有患儿家长同意接受正规外用和/或系统治疗银屑病方案，外用中弱效糖皮质激素软膏、0.03%他克莫司软膏、卡泊三醇软膏或者维A酸类软膏；伴发热、咽部红肿、扁桃体肿大、外周血白细胞或者中性粒细胞计数升高者给予系统抗生素治疗。

二、细胞与试剂

HaCaT细胞产自上海复祥生物科技有限公司。NGAL酶联免疫检测试剂盒（徐州微科曼得生物工程有限公司），NGAL蛋白标准品（北京义翘神州科技有限公司），兔抗人白细胞介素22（IL-22）多克隆抗体（美国Abcam公司），兔抗人肿瘤坏死因子α（TNF-α）多克隆抗体（美国Bioworld Technology公司），鼠抗人β肌动蛋白单克隆抗体、碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG、碱性磷酸酶标记马抗小鼠IgG抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），BCA试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），反转录PCR（RT-PCR）试剂盒（北京天根生化科技有限公司）。

三、方法

1.患儿病情评分与外周血采集：分别在治疗前和接受治疗2周后对患儿银屑病严重程度进行评分并采集静脉血标本。患儿病情严重程度按照银屑病皮损面积及严重程度指数（PASI）评分［3］。每例患儿抽取3 ml外周静脉血，进行血常规、生化指标等常规检查，剩余血液标本离心15 min（1 728×g）后，取上清液于-80℃冻存。

2.血清NGAL检测：按照NGAL酶联免疫检测试剂盒说明书操作，根据梯度浓度的NGAL标准品在450 nm处吸光度（A值）绘制标准曲线。将血清标本稀释1倍，检测各个样品的A值，根据标准曲线计算NGAL的实际浓度。

3.细胞培养及实验分组：将HaCaT细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养液中，在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。待细胞长满瓶底后，以0.25%胰蛋白酶消化细胞，接种于培养瓶内，置培养箱中培养24 h贴壁后，分别加入含0（对照组）、0.125、0.25、0.5、1 mg/L的NGAL［4］，培养12 h后收集细胞用于以下实验。

4.Western印迹法检测HaCaT细胞IL-22、TNF-α蛋白水平：取上述收集的细胞提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，取80 μg总蛋白样品电泳、转膜、封闭后，于4℃加入一抗（分别为IL-22抗体1∶1 000稀释，TNF-α抗体1∶500，β肌动蛋白抗体1∶1 000）孵育过夜，加入二抗（山羊抗兔IgG抗体1∶500，马抗小鼠IgG抗体1∶500）孵育2 h，加入显色液，凝胶成像系统观察结果，以IL-22、TNF-α条带与β肌动蛋白的灰度值比值表示蛋白相对表达水平。

5.RT-PCR 检测 HaCaT细胞 IL-22、TNF-α mRNA的表达：取上述收集的细胞提取总RNA，反转录合成cDNA。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。IL-22基因正向引物5′-TATCACCA ACCGCACCTTC-3′，反向引物5′-CAGATTGAGGG AACAGCACTT -3′，扩增片段长度173 bp；TNF-α基因正向引物 5′-TCTGGGCAGGTCTACTTTGG -3′，反向引物5′-GGTTGAGGGTGTCTGAAGGA -3′，扩增片段长度116 bp；β肌动蛋白（内参）正向引物5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，反向引物 5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG -3′，扩增片段长度205 bp。PCR反应体系为25 μl，扩增条件：94 ℃预变性3 min，94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35个循环，72℃延伸5 min。扩增产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果，以IL-22、TNF-α条带与β肌动蛋白的灰度值比值作为目的mRNA的相对表达水平。

6.统计学方法：采用SPSS 16.0软件，计量资料以±s表示。两样本均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。相关性采用Spearman相关分析方法。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、患儿治疗前后PASI积分、中性粒细胞计数和NGAL的变化

治疗2周后，银屑病患儿PASI积分、中性粒细胞数（×109/L）和NGAL（μg/L）水平（1.80± 1.19、6.16±0.76、90.86±0.75）与治疗前（10.38±3.42、11.01±2.85、113.48±21.26）相比均显著下降（t=31.42、18.34、16.37，均P＜ 0.001）。相关性分析显示，治疗前患儿血清中NGAL水平与PASI积分、外周血中性细胞数呈正相关（rs=0.918、0.799，P＜0.05）。

二、NGAL对HaCaT细胞TNF-α、IL-22 mRNA及蛋白表达水平的影响

各浓度NGAL组HaCaT细胞间TNF-α、IL-22 mRNA水平差异有统计学意义（均P＜0.001），蛋白表达水平差异亦有统计学意义（均P＜0.001），0.125、0.25、0.5、1 mg/L NGAL组mRNA、蛋白表达水平均显著高于对照组（均P＜0.05）。见表1，图1、2。

表1 不同浓度中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）对HaCaT细胞肿瘤坏死因子α、白细胞介素22 mRNA及其蛋白表达的影响（±s）

注：n=5。a与对照组相比，P＜0.05

组别1 mg/L NGAL组0.5 mg/L NGAL组0.25 mg/L NGAL组0.125 mg/L NGAL组0（对照组）F值P值肿瘤坏死因子α mRNA 1.044±0.015a 0.729±0.096a 0.471±0.037a 0.385±0.017a 0.213±0.051 193.28＜0.001蛋白1.373±0.058a 0.982±0.051a 0.844±0.049a 0.687±0.030a 0.391±0.031 318.80＜0.001白细胞介素22 mRNA 1.151±0.103a 0.822±0.096a 0.386±0.071a 0.269±0.045a 0.088±0.007 176.31＜0.001蛋白1.185±0.028a 1.194±0.050a 1.020±0.046a 0.745±0.048a 0.434±0.034 296.96＜0.001

相关性分析显示，TNF-α mRNA及蛋白表达水平与NGAL浓度呈正相关（rs=0.981、0.981，均P＜0.05）；IL-22 mRNA及蛋白的表达与NGAL浓度呈正相关（rs=0.973、0.934，均P＜ 0.05）。

讨 论

银屑病最具特征性的病理表现为中性粒细胞聚集。儿童银屑病和感染的关系更为紧密，其中以急性点滴状银屑病患儿居多［5］。本研究入组的新发银屑病患儿中性粒细胞水平明显升高，34.7%的患儿伴发热，66.3%的患儿有咽部红肿或者扁桃体肿大等感染症状，进一步提示儿童银屑病与感染可能存在密切的联系。近年来有研究显示，7NGAL在银屑病皮损中的表达明显升高［6-7］。本研究结果显示，当银屑病患儿发病时，外周血中性粒细胞增多同时伴外周血NGAL升高，经过治疗后，随着皮损的好转，患儿外周血中性粒细胞恢复正常，同时血清中NGAL水平会明显下降。这提示，外周血NGAL可能参与中性粒细胞在外周血的增殖和趋化过程，从而可能影响银屑病的皮损。本研究中儿童银屑病在发病时皮损PASI积分、外周血中性粒细胞数量也与外周血中NGAL水平正相关。结合相关文献，我们认为NGAL可能在感染诱发儿童银屑病的发病过程中发挥重要作用。

TNF-α是一类重要的炎症细胞因子，由活化的巨噬细胞和T细胞产生，可调节免疫应答和炎症反应，抵御各种微生物感染，也是银屑病发病核心致病因子之一，可通过多种方式直接或间接诱导银屑病发生。前期研究［4］显示，NGAL能刺激HaCaT细胞增殖。本研究显示，NGAL可促进HaCaT细胞中TNF-α的表达，提示NGAL可能通过诱导TNF-α的表达在银屑病发病机制中起重要作用。银屑病是一种主要由T细胞介导的免疫性疾病，分泌IL-22的Th17、Th22细胞，在银屑病皮损及外周血均可见升高［8］。IL-22可通过与IL-22受体1（IL-22R1）和IL-10R2组成的IL-22受体复合物产生效应。IL-22R1不表达于免疫细胞，只表达于特定器官的靶细胞，银屑病中表达IL-22R1的角质形成细胞是IL-22的主要靶细胞［9］。IL-22能直接作用于角质形成细胞，发挥促增殖及抑制晚期分化作用，是免疫细胞和角质形成细胞相互作用的桥梁分子。本研究提示，NGAL能刺激HaCaT细胞促进IL-22及其mRNA的表达，高剂量NGAL的刺激作用更为明显。本研究中NGAL刺激后HaCaT细胞中TNF-α与IL-22的表达均增高，但后期是TNF-α还是TNF-α与IL-22协同促进HaCaT细胞增殖，还需进一步研究。

综上，本研究显示，NGAL在银屑病患儿血清中高表达，且与患儿的皮损严重程度、外周血中性粒细胞计数呈正相关，NGAL能够上调HaCaT细胞TNF-α、IL-22蛋白及mRNA的表达。提示银屑病患儿在感染早期，中性粒细胞产生的NGAL能够刺激中性粒细胞产生前炎症刺激因子，诱导中性粒细胞迁徙，随后加重炎症反应并刺激细胞增殖，导致银屑病形成。但NGAL在银屑病的发病机制中，具体通过哪些途径促进皮肤表皮细胞TNF-α、IL-22生成，还有哪些因子参与和维持NGAL持续放大性的炎症反应过程，尚需进一步明确。