银杏叶提取物EGB761对缺氧心肌细胞凋亡的保护作用及分子机制研究

李鹏盈，卢成志，周小波，王桂贤

1.天津市东丽区东丽医院（天津300300）；2.天津市第一中心医院心内科（天津300192）

缺血性心脏病（Ischemic heart disease，IHD）是威胁人类健康的常见病之一。IHD是因冠脉病变引起心肌缺血缺氧，导致心肌细胞凋亡、坏死损伤。这其中缺氧所导致的过度凋亡是该疾病的病因之一。既往研究表明，银杏叶提取物761（Ginkgo biloba extract，EGB761）具有提高超氧化物歧化酶 （Superoxide dismutase，SOD）活性及抗自由基作用［1］。而EGB761对心肌缺血及缺血再灌注损伤有预防和治疗作用［1］，也可抑制由缺氧损伤引起的心肌细胞凋亡作用［2］，但目前为止其药理作用机制尚不清楚。研究发现，过氧化物酶增殖物激活受体γ（Peroxisome proliferater－activated receptor，PPAR－γ）在心肌细胞中发挥保护作用，可减轻心肌损伤，降低炎症反应对心肌的损伤等［3］。本实验就银杏叶提取物EGB761对缺氧心肌细胞凋亡及其分子机制进行初步探讨，以期明确上述具体机制，为缺血性心脏病的精准治疗提供参考。

材料与方法

1 试验药物 EGB761是一种银杏叶提取物，又称金纳多（Ginaton），购自德国 Wiumar Schwabe公司，批号为9840808，其成分稳定，专利受到永久保护，是当今改善脑及末梢血循环障碍的理想药物［4］。EGB761的有效成分是24%的总黄酮和6%的萜类（银杏内酯，银杏苦内酯）。总黄酮的药理作用主要表现在自由基清除方面，萜类主要表现为血小板活化因子（PAF）的拮抗作用和神经细胞的保护作用［5］。本研究用DMSO溶解并稀释EGB761，用于后续实验。

2 动 物 SF级雌性SD孕鼠40只（中国科学院动物中心），取出生1dSD乳鼠（雌雄不拘）为实验动物。

3 试 剂 DMEM／F12培养基（美国Gibco公司，11320033，500ml），胎牛血清（美国 Gibco公司，10099141，500ml），EGB761（德国 Wiumar Schwabe公司，9840808），Trizol（美国invitrogen公司，15596018，100ml），PCR逆转录试剂盒（北京全式金公司，AT401－01，50rxns×20μl），sybgreen法实时定量 PCR试剂盒（北京全式金公司，AQ101－01，1ml），MTT（北京鼎国昌盛生物公司，298931，250mg），LDH、SOD检测试剂盒（南京建成生物公司，A020－2，96T；A001－3，96T），Hoechst33342染色试剂盒（上海碧云天生物技术公司，C1026，50ml），引物（上海生工生物公司），Bax、Bcl－2、Caspase－3、NF－κB－p65、I－κB、PPAR－γ抗体（美国abcam公司），其余试剂为国产分析纯，设计引物 PPAR－γ （141bp）： 上 游 TGCTGGTGATCAGAAGGCTG下游 TGTGTCAACCATGGTAATTTCAGT；NF－κB－p65（131bp）：上 游 TTCAACAT GGCAGACGACGA 下 游 AGGTATGGGCCATCTGTTGAC；I－κB （200bp）：上 游 AGATGAGTTGCCCTACGATGAC 下游 ATAGAATGCTCGGGG－CTAGG；Casp3 （169bp）：上 游GGAGCTTGGAACGCGAAGAA 下游 ACACAAGCCCATTTC AGGGT；Bax（110bp）：上游 TTGCTACAG－GGTTTCATCCAGG下游 CACT CGCTCAGCTTCTTGGT；Bcl－2（153bp）：上游 AGGATAACGGAGGCTGGGATG下游 CTCACTTGTGGCCCAGGTAT；β－actin（174bp）：上游 AGATCAAGATCAT TGCTCCTCCT 下游 ACGCAGCTCAGTAACAGTCC。

4 方 法

4.1 乳鼠心肌细胞的原代培养：取新生乳鼠，无菌状态下开胸剪取心尖心肌组织，剪碎，酶解法37℃消化剪碎组织，终止消化后离心收集沉淀心肌细胞，以加入10%胎牛血清的DMEM／F12培养基孵育1h，弃去上清悬浮细胞，贴壁细胞即为原代心肌细胞，培养4 d后用于实验。

4.2 实验分组及心肌细胞缺氧损伤模型建立：将搏动状态良好，生长密度无明显差异的心肌细胞随机分组：①对照组：正常培养；②缺氧组：培养的原代心肌细胞换无血清培养基后置于缺氧混合气（95%N2－5%CO2）预充的单向气流缺氧装置中，检测排气口氧浓度低于1%，置于37℃培养箱内进行细胞缺氧［6］；③EGB7615μg／ml组：心肌细胞缺氧处理前加入5μg／ml EGB761；④EGB76110μg／ml组：心肌细胞缺氧处理前加入10μg／ml EGB761；⑤EGB76120μg／ml组：心肌细胞缺氧处理前加入20μg／ml。

4.3 心肌细胞缺氧时间的确定：将正常的原代心肌细胞接种于数块96孔细胞培养板内，分为对照组和缺氧6、24、48h组，处理后使用MTT法检测细胞活性，在波长490nm处测定各孔OD值，以选取缺氧处理时间。

4.4 LDH活性的测定：将正常的原代心肌细胞接种于数块24孔细胞培养板内，按实验分组方法分为5组，按以上实验确定的缺氧时间处理细胞，缺氧完成后取细胞上清，LDH酶活性检测试剂盒检测LDH活性。

5 SOD活性测定 将正常的原代心肌细胞接种于24孔细胞培养板内，按以上分组及条件处理细胞，缺氧完成后超声粉碎细胞，取样，SOD酶活性检测试剂盒检测SOD活性。

6 Hoechst染色检测细胞凋亡情况 将正常的原代心肌细胞接种于6孔细胞培养板内，按以上分组及条件处理细胞，培养完成后弃培养基，PBS液清洗3次，加入 Hoechst 33342染液（1mg／ml），避光室温染色15min，弃染液，PBS液清洗3次，用荧光显微镜观察，拍照。

7 实时定量 PCR 检测 PPAR－γ，NF－κB－p65、I－κB、Bax、Bcl－2、Caspase－3基因表达 细胞接种于数块6孔板内，按以上分组及条件处理细胞，Trizol法提取细胞总RNA，sybgreen法实时定量PCR检测各组信号分 子 PPAR－γ、NF－κB－p65、I－Κb，凋 亡 相 关 基 因Bax、Bcl－2、Caspase－3表达情况。

8 Western－blot法检测 PPAR－γ、NF－κB－p65、I－κB、Bax、Bcl－2、Caspase－3蛋白表达情况 细胞接种于数块培养皿内，按以上分组及条件处理细胞，细胞裂解提取总蛋白，电泳转印后ECL法显影，灰度分析各条带，与内参进行半定量分析各组蛋白表达量的变化。

9 统计学方法 所有数据均使用Graphpad Prism 6.0软件进行统计学处理及制图，结果均以均数±标准差表示。各组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为统计学有统计学意义。各组蛋白表达水平以Image J 2.0软件进行半定量灰度分析。

结 果

1 EGB761对缺氧原代心肌细胞存活率的影响MTT结果显示：6h时缺氧组较对照组细胞存活率显著下降，而加入10μg／ml EGB761和20μg／ml EGB761时，缺氧原代心肌细胞的存活率明显升高，5μg／ml EGB761则没有效果。12h及24h缺氧组较对照组细胞存活率下降明显，但12h及24hEGB761各浓度组与缺氧组比均无差异（P＞0.05），见表1。

表1 不同浓度EGB761对缺氧原代心肌细胞存活率的影响

2 EGB761对缺氧原代心肌细胞上清液LDH含量变化及细胞内SOD活性影响 与对照组相比，缺氧组LDH 漏出量增加，10μg／ml、20μg／ml EGB761均可显著减少缺氧心肌细胞LDH外漏，且20μg／ml EGB761作用效果更好，但5μg／ml EGB761作用效果不明显，与对照组相比，缺氧组细胞内SOD活性降低，不同浓度的EGB761均可显著升高缺氧心肌细胞内SOD活性，且浓度越高，效果越好，见表2。

3 EGB761对缺氧原代心肌细胞凋亡的影响Hoechst33342是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，正常细胞的细胞核出现弥漫均匀的低强度荧光，而凋亡细胞的细胞核固缩，呈致密浓染或碎块状致密浓染或半月形凝聚。Hoechst33342染色检测细胞的凋亡情况，结果发现，和对照组相比，缺氧组可明显诱导原代心肌细胞凋亡，10μg／ml、20μg／ml EGB761均可明显抑制缺氧心肌细胞凋亡，且20μg／ml EGB761抑制效果更明显，而5μg／ml EGB761对缺氧心肌细胞的凋亡作用效果不明显（图1）。

表2 EGB761对缺氧原代心肌细胞上清液LDH含量变化及细胞内SOD活性影响

图1 Hoechst33342染色检测原代心肌细胞凋亡情况

4 EGB761对缺氧原代心肌细胞凋亡相关基因mRNA和蛋白表达的影响 为了进一步探讨EGB761对缺氧原代心肌细胞凋亡的影响，我们采用Real time PCR和 Western blot方法，分别从凋亡基因mRNA和蛋白表达方面探讨EGB761对缺氧原代心肌细胞的保护作用。结果显示，与对照组比，缺氧组Bcl－2的mRNA和蛋白水平均明显下调，Bax mRNA和蛋白水平均明显上调，Bax／Bcl－2比率显著升高，且 Caspase－3 mRNA和蛋白水平均明显上调；10μg／ml、20μg／ml EGB761均可显著升高缺氧心肌细胞Bcl－2的mRNA和蛋白表达水平，降低Bax、Caspase－3的mRNA和蛋白表达水平，且20μg／ml EGB761作用效果更明显，但5 μg／ml EGB761对缺氧心肌细胞的凋亡基因作用效果不明显（图2－3）。

图2 EGB761对缺氧原代心肌细胞凋亡相关基因mRNA表达的影响

图3 EGB761对缺氧原代心肌细胞凋亡相关基因蛋白表达的影响

5 EGB761对缺氧原代心肌细胞PPAR－γ、NF－κB－p65、I－κB mRNA和蛋白表达的影响为了探究EGB761抑制缺氧心肌细胞凋亡的分子机制，我们采用Real time PCR 和 Western blot方法，分别从 mRNA和蛋白表达方面检测凋亡相关信号通路中关键因子的表达。结果显示，与对照组比，缺氧组PPAR－γ、I－κB的mRNA和蛋白表达均明显降低，NF－κB－p65的mRNA和蛋白表达明显上升，表明缺氧抑制原代心肌细胞PPAR－γ通路，并激活NF－κB－p65的活性；不同浓度的EGB761均可显著上调缺氧心肌细胞PPAR－γmRNA和蛋白表达，且浓度越高，上调作用越明显；10μg／ml、20μg／ml EGB761显著下调 NF－κB－p65的 mRNA和蛋白表达，显著上调I－κB的mRNA和蛋白表达，但5μg／ml EGB761对缺氧原代心肌细胞 NF－κB－p65和I－κB的表达没有作用，表明EGB761可激活缺氧原代心肌细胞PPAR－γ通路，并抑制 NF－κB－p65的活性（图4－5）。

图4 EGB761对缺氧原代心肌细胞PPAR－γ、NF－κB－p65、I－κB mRNA表达的影响

图5 EGB761对缺氧原代心肌细胞PPAR－γ、NF－κB－p65、I－κB蛋白表达的影响

讨 论

心肌活动消耗的能源主要来自于有氧代谢，所以心肌对缺氧非常敏感。在缺氧环境下，线粒体功能出现障碍，从而启动线粒体凋亡途径，导致心肌细胞凋亡发生。而心肌细胞凋亡，又是决定心肌梗死面积得主要决定因素之一。银杏叶提取物EGB761是从银杏科植物叶子中提取的一种含有多种有效成分的混合物，主要有效成分是24%的总黄酮和6%的萜类（银杏内酯和银杏苦内酯）［4］，可以逆转心肌细胞的损伤发生，促进心肌细胞的存活［2］。然而其具体的作用机制尚不明确，本研究以原代培养的乳鼠心肌细胞为研究对象，采用低氧培养系统建立体外心肌细胞缺氧模型，研究发现缺氧显著降低心肌细胞的存活率，而银杏叶提取物EGB761可逆转这一现象（表1），与文献报道一致［8－9］。表明银杏叶提取物EGB761对缺氧状态下的心肌细胞具有保护作用。而这种保护作用可能是通过调控心肌细胞线粒体凋亡途径，从而抑制心肌细胞凋亡来实现的［10］。

心肌细胞损伤导致细胞浆内的酶释放外泄到培养液里，其中包括活性稳定的乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）。因此细胞培养液中LDH的活性可反映心肌细胞的损伤情况。在我们的实验中与对照组相比，缺氧损伤模型组LDH活性升高；而加入不同浓度的EGB761后，LDH活性随着EGB761浓度的升高逐渐降低（表2），表明EGB761抑制心肌细胞凋亡，在一定程度上维持了心肌细胞膜的完整性。

在缺氧状态下，心肌细胞线粒体功能障碍，而线粒体是活性氧的主要产生场所和影响目标。过多的活性氧会破坏线粒体正常功能、破坏细胞膜的正常结构，引起细胞凋亡［11－13］。超氧化物歧化 酶 （Superoxide dismutase，SOD）是生物体内天然的氧自由基清除剂，可抑制由氧化应激引起的细胞凋亡［14］，也可以改善心脑血管疾病［15］。有文献报道，银杏叶提取物也可提高SOD的活性而起到清除氧自由基的作用，抑制由缺氧诱导的心肌细胞凋亡［16］。本研究也发现，缺氧可导致SOD活性下降、心肌细胞凋亡增加；而加入EGB761后，细胞内的SOD活性升高，同时心肌细胞凋亡减少，且20μg／ml浓度组效果优于10μg／ml浓度组（表2）。而在线粒体凋亡途径中，Bcl－2／Bax－Caspase－3信号通路基因、蛋白的表达量变化可以直接反应细胞凋亡情况。闵宁斌等研究发现，EGB通过抑制Bax的表达及提高Bcl－2的表达水平来逆转心肌细胞的损伤发生［2］。Qiao ZY等在缺氧再灌大鼠模型中发现，EGB761对大鼠心肌细胞的保护作用与下调Bax、细胞色素C和Caspase－3的表达有关；Bcl－2的高表达通过抑制线粒体释放细胞色素C和阻滞Caspase－3的激活来防止缺氧再灌引起的细胞凋亡［18］。本研究也得到了与之一致的结果（图2－3），分子水平上说明EGB761通过线粒体凋亡途径抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Peroxisome proliferater－activated receptor，PPAR－γ）是对机体代谢过程起重要调控作用的一种核激素受体，不仅在脂质代谢、糖代谢中发挥作用，同时还作用于细胞增殖分化、凋亡和炎症调控等过程［3，19－20］。Zeng等研究发现，MirRNA－128通过激活PPAR－γ抑制缺氧所致的心肌细胞凋亡［21］。Suzuki T等研究发现，心房肽通过激活PPAR－γ实现心肌保护作用［22］。Han J等的研究发现，迷迭酸通过激活PPAR－γ下调NF－κB通路抑制缺氧再灌大鼠的心肌细胞凋亡［23］。进而有研究报道PPAR－γ对细胞的抗凋亡作用是通过下调NF－κB通路来实现的［24－25］。本研究发现，缺氧诱导心肌细胞发生凋亡，并抑制PPAR－γ和I－κB的表达，促进 NF－κB的表达，NF－κB通路被激活；而加入EGB761后，心肌细胞凋亡减少，PPAR－γ表达上调的同时，I－κB表达上调，NF－κB表达下调，NF－κB通路被抑制。

这些结果表明EGB761通过线粒体途径抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡。而EGB761对心肌细胞的保护作用与PPAR－γ、NF－κB信号通路激活有关，但其具体分子机制还是接下来的继续研究方向。