焦脱镁叶绿酸甲酯介导光动力抑制人乳腺癌细胞MCF-7迁移

2019-01-05黄礼义林海丹虞乐华白定群

中国药理学通报 2019年1期

黄礼义，林海丹，虞乐华，白定群

(1. 重庆医科大学附属第一医院康复医学科，重庆 400016；2. 重庆医科大学附属第二医院康复医学科，重庆 400010)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率在女性癌症中居首位[1-2]。造成乳腺癌患者死亡的主要原因是肿瘤转移[3]，因此，控制肿瘤转移是治疗乳腺癌的主要目标之一。光动力疗法(photodynamic therapy, PDT)是一种结合光敏剂(photosensitizer, PS)和特定波长光的新型疗法，通过活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生发挥光化学作用，其安全性高、副作用小，广泛应用于临床各种肿瘤治疗[4]。焦脱镁叶绿酸甲酯(pyropheophorbide-a methyl ester，MPPa)是一种叶绿素衍生物，属于第二代光敏剂。本课题组前期实验表明，MPPa介导光动力可以诱导人乳腺癌细胞和人卵巢癌细胞凋亡[5-6]，从而发挥治疗作用，但是MPPa介导光动力对乳腺癌细胞迁移能力的影响尚未见报道。本研究拟探讨MPPa介导光动力对人乳腺癌细胞MCF-7迁移能力的影响，以期为乳腺癌的治疗提供新的思考。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞与试剂人乳腺癌细胞MCF-7由重庆医科大学生命科学研究院惠赠。光敏剂MPPa(美国 Sigma-Aldrich 公司)，以二甲亚砜(DMSO)溶解至10 mmol·L-1，避光储存于-80 ℃冰箱；LED光源(重庆京渝激光科技有限公司)；胎牛血清FBS(德国PAN公司)；RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)； CCK-8(日本同仁公司)；DCFH-DA(美国 Sigma-Aldrich 公司)；Transwell小室(美国Millipore公司)；E-钙黏蛋白(E-cadherin)抗体、PTEN抗体、Akt抗体、p-Akt 抗体(美国CST公司)。

1.1.2仪器细胞培养箱、全波长酶标仪(美国 Thermo Scientific 公司)；高速离心机(美国 Sigma 公司)；生物显微镜(日本 Olympus 公司)；倒置荧光显微镜(德国Zeiss公司)；电泳仪(美国 Bio-Rad 公司)；化学发光成像系统(法国Vilber Lourmat公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养及分组人乳腺癌细胞MCF-7于37 ℃、5% CO2条件下，在含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI 1640培养基中培养。将处于对数生长期的MCF-7细胞随机分为对照组、单药组(仅MPPa处理)、单光组(仅光照处理)和MPPa-PDT组(MPPa和光照处理)。细胞贴壁后，单药组和MPPa-PDT组更换为含2 μmol·L-1MPPa 的培养基避光培养，对照组和单光组更换为等体积的完全培养基。24 h后，去除MPPa并接受光照处理，连续输出方式，功率密度30 mW/cm2。

1.2.2CCK-8检测MCF-7细胞活性 MCF-7细胞以5×103个/孔接种于96孔板中，待其贴壁后进行分组，并进行光动力处理，光敏剂浓度为0、0.5、1、2、4 μmol·L-1，光照时间为0、30、60、90、120 s，光照能量为0、0.9、1.8、2.7、3.6 J/cm2(光照能量=光照时间×功率)。24 h后，更换培养基为含10% CCK-8试剂的无血清培养基，将细胞放入孵箱中继续培养，酶标仪检测450 nm波长下各孔的吸光度。按公式计算细胞存活率：存活率=(实验组OD值-空白对照组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值)×100%。空白对照组为含CCK-8培养基而不含细胞的孔，阴性对照组为含CCK-8培养基和细胞的孔，实验组为含CCK-8培养基和细胞且受处理的孔。

1.2.3DCFH-DA染色检测MCF-7细胞内ROS的产生 MCF-7细胞以5×103个/孔接种于96孔板中，待其贴壁后，随机分组进行光动力处理，1 h后去掉原培养基，PBS洗涤细胞2次，加入10 μmol·L-1DCFH-DA无血清培养基，在孵箱中继续培养30 min。弃培养基，PBS洗涤细胞2次，荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.4Transwell实验观察MCF-7细胞迁移能力 MCF-7细胞以1×105个/孔接种于6孔板中，随机分组后接受相应处理。Transwell小室放置于24孔板中，光动力处理后12 h消化细胞，无血清培养基重悬，以1×105个/孔接种于Transwell小室中，下室加入750 μL完全培养基，在孵箱中继续培养24 h。取出细胞，PBS洗2遍，棉签刮去上室中未迁移的细胞，多聚甲醛固定上室及下室30 min，三蒸水清洗小室2次，结晶紫染色5 min，三蒸水清洗2次，晾干后于显微镜下观察并拍照。

1.2.5细胞划痕实验观察MCF-7细胞迁移能力 MCF-7细胞以1×105个/孔接种于6孔板中，光照前使用100 μL枪头在孔板中划痕，PBS洗2遍，更换培养基为无血清培养基后接受光照处理。于孵箱中继续培养，并于0、24、48 h在显微镜下观察并拍照。

1.2.6Western blot 检测E-cadherin、PTEN、Akt、p-Akt蛋白的表达变化 MCF-7细胞接受相应处理后，于冰上加入裂解液(RIPA ∶PMSF=100 ∶1)裂解10 min，细胞刮刮下细胞，超声粉碎5次，12 000×g离心15 min，BCA法测定蛋白浓度，最终配平为等浓度、等体积的蛋白样品。SDS-PAGE后，湿转法将蛋白转移至PVDF膜，5% 脱脂奶粉封闭2 h，孵育一抗4 ℃过夜，孵育二抗后显影。

2 结果

2.1MPPa-PDT抑制MCF-7细胞活性如Fig 1所示，低浓度的MPPa(0～2 μmol·L-1)和单纯光照对MCF-7细胞活性无明显影响，高浓度的MPPa(4 μmol·L-1)对MCF-7细胞活性有较明显的影响(P<0.05)，因此，选择2 μmol·L-1MPPa 用于后续实验。MPPa联合光照处理对细胞活性有明显的抑制作用，其抑制作用呈剂量依赖性。光能量密度为0.9 J/cm2时，细胞存活率为(52.8±2.20)%，后续实验即采用该能量密度。

Fig 1 Effect of MPPa-PDT on MCF-7 cell

Energy density(J/cm2)=Power density(30 mW/cm2)×Illumination time(s).*P<0.05vscontrol group.

2.2MPPa-PDT诱导MCF-7细胞内ROS产生如Fig 2所示，ROS可将不带荧光的DCFH-DA氧化为带绿色荧光的DCF,DCF的量可以反映细胞内ROS的量。MPPa-PDT处理后，细胞内ROS明显增加，荧光强度高于对照组、单药组和单光组(P<0.05)，三组间差异无统计学意义。上述结果表明，MPPa-PDT可诱导MCF-7细胞产生ROS。

2.3MPPa-PDT抑制MCF-7细胞迁移Fig 3的Transwell结果显示，与对照组、单药组、单光组相比，MPPa-PDT组MCF-7细胞迁移数量明显低于其他3组(P<0.05)，三组间差异无统计学意义。Fig 4的划痕实验结果显示，24 h时，MPPa-PDT组与对照组之间细胞迁移差异不明显，48 h时，对照组细胞迁移面积明显大于MPPa-PDT组，差异有统计学意义。上述结果表明，MPPa-PDT可以抑制MCF-7细胞的迁移能力。

Fig 2 Production of ROS and quantification in MCF-7 cells(×400)

Fig 3 Migration of MCF-7 cells inhibited by MPPa-PDT(×400)

2.4MPPa-PDT对E-cadherin、PTEN、Akt、p-Akt蛋白表达的影响如Fig 5所示，MPPa-PDT组E-cadherin、PTEN蛋白表达高于空白组、单药组和单光组(P<0.05)，p-Akt蛋白表达低于空白组、单药组和单光组(P<0.05)，且3个对照组间差异无统计学意义，Akt蛋白表达4组间无明显差异。

3 讨论

肿瘤转移是肿瘤治疗效果不佳和肿瘤相关性死亡的主要原因之一[7]。目前，乳腺癌的治疗主要以外科手术和药物为主[8]，但外科手术和化疗药物会带来严重的副作用，因此，寻找安全有效、毒副作用低的治疗方法显得尤为重要。研究表明，MPPa-PDT可以诱导肿瘤细胞凋亡、坏死和自噬，但MPPa-PDT对肿瘤迁移的研究尚未见报道。本研究探讨MPPa-PDT对人乳腺癌细胞MCF-7迁移能力的影响及其可能的机制，期望为临床治疗乳腺癌提供思路。实验结果表明，2 μmol·L-1MPPa 联合0.9 J/cm2光能量密度可以明显抑制MCF-7的细胞活性。

单独应用一定浓度的光敏剂或者光照通常对细胞无明显毒性，但当二者结合时所产生的ROS会对细胞造成明显的影响。ROS是PDT治疗效应的核心部分，它参与广泛的细胞信号转导，研究表明，PDT通过ROS产生，抑制肿瘤细胞侵袭迁移[9-10]。本实验结果表明，MCF-7细胞经光动力处理后，ROS水平明显升高，可能抑制乳腺癌细胞的迁移能力。Du等[11]发现，结合藻青蛋白和血卟啉介导光动力治疗，抑制MCF-7细胞的增殖和迁移。本实验Transwell迁移实验和划痕实验结果也表明，MPPa-PDT明显抑制了MCF-7细胞的迁移能力,而单纯使用MPPa或单纯光照对细胞的迁移能力无明显影响。

Fig 4 Migration of MCF-7 cells inhibited by MPPa-PDT(×50)

上皮-间充质转化(epithelial mesenchymal transition ，EMT)在肿瘤转移中起重要作用，EMT发生时，细胞-细胞连接和细胞极性消失，肌动蛋白细胞骨架重组失败，纺锤样间质形成，导致细胞运动及迁移能力增强[8]。E-cadherin是EMT中一个关键因子，其功能失调导致肿瘤细胞侵袭、迁移和转移传播。研究发现在乳腺癌病人中，E-cadherin水平与肿瘤转移、不良预后、肿瘤复发有关[8]。本实验结果表明，MPPa-PDT上调MCF-7细胞的E-cadherin水平，表明MPPa-PDT可能通过上调E-cadherin，抑制肿瘤细胞发生EMT,进而抑制肿瘤细胞迁移。

Akt是细胞内重要的信号转导通路，涉及细胞的存活、生长、转移和代谢，发生EMT的细胞中可检测到Akt的激活，Akt激活与肿瘤侵袭迁移密切相关。PTEN作为一种抑癌基因，可使三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol trisphosphate，PI3P)脱磷酸化，抑制Akt的激活[12]，阻碍EMT的发生。实验结果表明，MPPa-PDT处理后，MCF-7细胞中PTEN蛋白表达量增加，p-Akt蛋白表达量降低，提示MPPa-PDT可能通过PTEN/Akt信号通路，降低MCF-7细胞迁移能力。

综上所述，MPPa-PDT可明显降低MCF-7细胞的迁移能力，其作用机制可能与E-cadherin上调和PTEN/Akt信号通路有关。基质金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases，MMPs)在肿瘤的侵袭迁移中起关键作用，其中MMP-2和MMP-9可降解胞外基质和Ⅳ型胶原[13]，促进肿瘤转移，而且MMP-9可诱导EMT的发生，因此，MMP-2和MMP-9常作为肿瘤进展的标志物[14]。MPPa-PDT是否通过抑制MMP-2和MMP-9表达来抑制肿瘤的侵袭迁移有待进一步研究。