Lamin A/C在干细胞表观遗传药理学中的调控作用

赵林平，余细勇

(广东省分子靶标与临床药理学重点实验室，广州医科大学药学院，广东 广州 511436)

近年来，干细胞治疗为许多难治之症带来了希望，干细胞移植在治疗心肌梗死[1]、阿尔茨海默病[2]等疾病方面成效明显。但是对于干细胞体外培养仍面临以下问题：(1) 在培养过程中，干细胞易凋亡和分化；(2) 在一定的培养条件下，很难对细胞应力进行检测；细胞微环境(stem cells niche)也称干细胞龛，是机体组织储存干细胞的位置，是一个相对稳定的环境。干细胞微环境主要包括细胞因子、基质细胞、细胞外基质、力学信号等。力学刺激的产生主要有两个途径：内源性力学信号和外源性力学信号。内源性力学信号是通过细胞骨架蛋白的重组，以及肌动球蛋白的收缩，作用于细胞外基质以及基质细胞。外源性力学信号是通过机体的物理运动所产生机械拉伸、剪切、收缩等刺激引起细胞效应[3]。因为机械刺激对干细胞命运的调控至关重要，所以就如何在体外模拟体内相适应的细胞应力模型成为了研究热点。本文主要综述微环境中力学信号对干细胞A型核纤层蛋白(Lamin A/C)的调节，以及Lamin A/C的功能变化对染色体修饰、基因表达调控的影响。

1 核纤层蛋白的结构特征

核纤层由A型核纤层蛋白及B型核纤层蛋白共同组成，处于内核膜与染色质之间，起着维持细胞核的形态、保护染色质，以及与核纤层连接蛋白共同调节细胞的增殖、分化、衰老等作用(Tab 1)。B型核纤层蛋白包括Lamin B1、Lamin B2、Lamin B3，分别由LMNB1和LMNB2编码。A型核纤层蛋白分为Lamin A(72 ku)和Lamin C(65 ku)，是由同一个基因LMNA转录、翻译而来。不同的是，Lamin A与Lamin C 在碳末端有着不同的氨基酸序列，并且Lamin A是由前体PrelaminA(74 ku)经剪切修饰而来。在有丝分裂期间，A型Lamins溶解，并在有丝分裂中期游离于核浆内，法尼基化B型Lamins则仍保留在核膜上。哺乳动物一般表达B型Lamins，而A型Lamins则主要表达于除胚胎干细胞之外的所有细胞中[4]。

Tab 1 Lamin-associated proteins and function

2 力学刺激对Lamin A/C的调控

A型Lamins的表达量与组织器官的硬度呈正相关，随着组织器官硬度增加，Lamin A/C的表达量也随之增加，具体表现为股骨表达量最高，软骨组织其次，最少的为大脑组织[5]。细胞也是如此，Lamin A/C在胚胎干细胞中几乎不表达[4]。在骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、人造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)、心肌细胞等细胞中表达量高[11]，故细胞微环境对Lamin A/C的调节作用。Lamin A/C维持细胞核内稳定的同时，参与细胞外应力刺激转导的过程。Swift等[11]首次发现，Lamin A/C参与力学信号的转导及其机制。将MSCs接种于0.3 kPa与40 kPa的聚丙烯酰胺基底的培养皿上，发现40 kPa组MSCs的Lamin A/C、myosin-IIA表达量明显高于0.3 kPa组，且Lamin A/C磷酸化水平较0.3 kPa组明显降低，并阐明力学刺激调控Lamin A/C表达的机制，表现为Lamin A/C蛋白通过维甲酸信号通路，调控LMNA的转录，myosin-IIA通过血清反应因子(serum response factor，SRF)信号通路调控MYH9转录。在硬度较大的培养皿中，myosin-IIA磷酸化降低，并通过myosin-IIA的收缩紧张，同时调控着Lamin A/C的磷酸化和LMNA的转录。

3 Lamin A/C功能变化与染色体修饰

在细胞核边缘，常染色体和异染色质通过纤层蛋白连接区域(Lamins-associated domain, LADs)与Lamin A/C相连，Lamin A/C功能的变化影响细胞表观遗传的标志。

3.1LaminA/C功能改变与组蛋白甲基化研究表明，LMNA基因突变影响着染色质在核内的定位与分布。在LaminA(LAΔ50)突变的细胞，细胞核边缘异染色质明显减少，通过检测异染色质的标志发现，H3K27me3及EZH2下调，并伴随着结构异染色质的标志H4K20me3的上调[12]。同样，Gesson等[7]实验证明，在小鼠Tmpo WT和KO的细胞中，Lamin A/C结合常染色质区域抑制转录(H3K9me3、H3K27me3)和激活转录(H3K4me3、H3K9ac)的组蛋白标记增多，而未结合区域则相应减少，却不影响总体基因表达。相比于异染色质，结合与未结合区域表观遗传的标记却未改变，而未结合区域基因表达却上升。表明Lamin A/C以及Lamin A/C-Lap2α复合物在细胞核内扮演着表观遗传调控的角色。

3.2LaminA/C功能变化与组蛋白乙酰化LaminA同样影响着组蛋白乙酰化，Barateau等[13]在先天性肌营养不养的患者细胞中发现LMNA的新突变位点R388P，并将该突变基因转染至C2C12成肌细胞中，可引起组蛋白H3K9乙酰化。已证实SIRT1影响着干细胞衰老[14]，Liu等[15]进一步研究证明，在细胞内LaminA与SIRT1直接连接，且LaminA是激活SIRT1去乙酰化作用所必需的。在早老病患者(Hutchinson-Gilford progeria syndrome，HGPS)的细胞中，大量的LaminA被早老蛋白(progerin)替代，SIRT1失去对p53的去乙酰化作用，从而引起细胞衰老。

4 Lamin A/C功能变化与基因表达

LMNA基因突变可引起早老病、扩张型心肌病、埃-德二氏肌营养不良(Emery-Dreifuss muscular dystrophy，ED-MD)等疾病，而目前研究尚未发现B型Lamins突变引起的疾病。早老病是一种致命的人类疾病，患者主要表现为动脉粥样硬化和血管平滑肌细胞功能的异常。研究获取早老病患者(LMNA在Gly608Gly位置突变)的成纤维细胞，发现其细胞核畸形、Lamin B、Lap2β、异染色质的标记H3K9me3、HP1α及HDAC1都发生相应下调，同时细胞增殖的标记Ki67也发生下调。并且将成纤维细胞用OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC重编程为HGPS-iPSC后，与BJ-iPSC(野生型)对比，在常染色体上有33个基因发生不同的甲基化，但不引起细胞功能改变。然而，将BJ-iPSC、HGPS-iPSC分别诱导分化为血管平滑肌细胞(smooth muscle cells, SMCs)时，HGPS-iPSC来源的SMCs表现为衰老相关基因表达上调，引起细胞早老[16]。Cohen等[17]利用lmna-/-小鼠研究lmna-/-肌成细胞与野生型肌成细胞的蛋白质组学，发现240种蛋白有明显差异，包括SUN2、Smad2、Smad3、MyoD等，并且肌成细胞的增殖及分化为肌细胞的能力明显低于正常细胞。

5 Lamin A/C对干细胞命运的调控

5.1LaminA/C对干细胞增殖的影响Lamin A/C对干细胞增殖的影响是通过直接调控pRB的表达，并与pRB直接连接，以及通过Lap2α连接pRB抑制其降解，pRB结合E2F转录因子并降低其转录活性，从而抑制细胞增殖[9]。

5.2LaminA/C对干细胞分化的影响干细胞具有很强自我复制的能力，并且在一定条件下能分化为多种细胞，然而使干细胞定向分化并用于临床治疗的方法有限。近年来关于细胞力学调控干细胞分化的研究逐渐增多。Bergqvist 等[10]发现，核内蛋白Samp1的表达在iPSCs分化过程中伴随Lamin A/C的表达而迅速上调，并与Lamin A/C、emerin相互作用，调节iPSCs的分化。Swift等[11]研究证明，在柔软环境中，MSCs趋于向脂肪细胞分化，并且证明敲低Lamin A/C能促进向脂肪细胞的分化，而在硬度较大的培养皿中，MSCs则向成骨细胞分化。紧随其后，Shin等[18]研究发现，Lamins蛋白水平影响着造血干细胞的分化，通过高表达LaminA、敲低LaminA的表达或加入维甲酸受体抑制剂调控造血干细胞向红细胞系、巨核细胞的分化。

5.3LaminA/C与干细胞衰老早老综合征患者一般是LMNA基因在Gly608Gly位置的突变，导致早老蛋白在细胞内的积累，从而影响细胞力学信号的转导、染色质的结构、重要信号通路的传导和基因的稳定性等，进而引起干细胞衰老。Lavasani等[19]研究证明，早老蛋白在细胞内的积累影响干细胞的增殖分化，并发现WT肌来源干细胞与HGPS干细胞共培养能修复HGPS干细胞的功能，并通过腹腔注射WT肌来源干细胞延长早老综合征小鼠的寿命。目前，主要运用HGPS多潜能干细胞模型来研究衰老，寻找药物作用靶点治疗早老综合征[16]。

6 Lamin A/C的细胞力学信号转导通路

细胞骨架不仅承担着保护细胞内细胞器、遗传物质不被物理运动破坏的重要作用，而且还扮演着力学感受器的角色。细胞骨架主要由肌动蛋白、细胞骨架连接蛋白、纤层蛋白等构成，当机械刺激作用于细胞膜上的整合素受体，使其活化内吞，激活下游通路中的黏着斑激酶(FAK)，或者通过ECM-integrins-talin-actin通路，使YAP/TAZ核转位或者由myosin-IIA紧张拉伸将力学信号传递至核膜上，再由Nesprins-SUNs-Lamin A/C复合物传导至核内调控基因表达[11,20-21]。Lamin A/C在这过程中起着重要作用，研究发现LMNA基因突变的肌前体细胞，其胞质骨架蛋白与细胞核骨架蛋白非正常连接，导致细胞骨架的张力与ECM的张力不一致[22]。

7 靶向Lamin A/C的药物研究进展

伴随着细胞表观遗传学的研究，涌现出了大批的表观遗传学药物[23]，而针对干细胞Lamin A/C作为药物靶点的研究较少。目前，绝大多数药物研究集中于治疗LMNA突变引起的早老病、扩张型心肌病、EDMD等。2014年，Larrieu等[24]发现小分子化合物Remodelin能通过抑制NAT10，达到改善LMNA突变引起的细胞核畸形、染色质松散、DNA损伤。2016年，Egesipe等[25]研究发现，二甲双胍能降低HGPS-MSCs中早老蛋白的沉积，进而恢复HGPS-MSCs的功能。

8 问题与展望

作为微环境中的组成部分，力学信号调控着干细胞命运，并逐渐被人们重视。然而仍存在着一些问题：首先，机械刺激诱导干细胞定向分化的机制仍不清晰；其次，细胞核质内存在的Lamin A/C是否参与力学信号转导和参与细胞的表观遗传调控？最后，LaminA、LaminC 在参与干细胞表观遗传调控的过程中是否行使着不同的功能？随着科学技术的不断发展和研究的不断深入，相信这些问题都会被阐明，干细胞的临床治疗和研究将迎来新纪元。