ESRPs在上皮间质转化中的作用及其调控机制研究进展

2019-01-05王白鹤孙建方

中国麻风皮肤病杂志 2019年2期

王白鹤孙建方

上皮-间质转化(EMT)使上皮细胞失去极性获得间充质表型，从而具有侵袭和转移的能力，它是胚胎发育所必需的过程[1]，并且与癌症进展相关[2]。除了受相关转录因子的调节外，EMT还可以在转录后水平被调控，上皮剪接调节蛋白1和2(ESRP1和ESRP2)已被描述为参与EMT相关的上皮特异性剪接调节剂。本篇文章主要针对ESRPs介导的剪接变体在EMT相关上皮表型调节中的作用和调控机制[3]，以及与肿瘤发生发展的相关性作一综述。

1 上皮-间质转化(EMT)程序

许多细胞外信号通路，比如TGFβ，Notch，Wnt，FGF和HGF能够通过诱导EMT-TF(Snail，Slug，ZEB1，ZEB2和Twist)的表达来促进EMT过程。这些信号传导途径与胚胎发育密切相关。转录因子的诱导通常导致E-钙黏蛋白的丧失，这是EMT的首要表现之一。 E-钙黏蛋白的抑制是通过在编码CDH1基因的E-钙黏蛋白的启动子位点的E盒处形成抑制性复合物来介导的。E-钙黏蛋白的丧失，以及紧密连接和黏附连接功能的丧失以及细胞顶端-基底极性都是EMT的标志，并且导致以间充质标记物的高表达为特征的细胞类型，例如波形蛋白表达，细胞形状变成纺锤形，以及获得迁移和侵袭能力[4]。反向程序MET在胚胎发育过程中驱动先前间充质细胞向上皮细胞转化，可能导致EMT途径的下调，但是关于抑制EMT或促进MET的特定转录途径目前研究较少。

EMT程序的失调与肿瘤发病机制密切相关。绝大多数致命的人类癌症是源自上皮组织的肿瘤，例如来源于乳腺、肺、胰腺和结肠的肿瘤。虽然早期肿瘤保留了许多正常上皮细胞的特征，但高度侵袭性的肿瘤获得间充质特征，从而可以侵入周围的基质[5]。实际上，在宫颈癌、结肠癌、甲状腺癌和乳腺癌的肿瘤侵袭过程中可以发现EMT的表达，包括E-钙黏蛋白表达的丧失，波形蛋白表达的增加和迁移能力的明显增强。尽管有大量的体内研究与异种移植或遗传小鼠模型支持EMT在肿瘤进展中的因果作用，但是EMT对人类癌症和转移的准确影响仍然存在争议，原因是原发肿瘤样本的证据不足[6]。有研究在癌旁组织发现了E-钙黏蛋白的低表达，其他转移的肿瘤细胞未显示EMT的迹象。最近发现，EMT还与干细胞特性和耐药性的获得有关[2]，这表明EMT在肿瘤发生中具有重要的选择性作用。由于胚胎发育的重要性以及尚未完全阐明的致癌作用，EMT过程有待进一步研究。

2 ESRPs在细胞上皮表型调节中的作用

使用各种生物信息学工具和功能性交互网络分析发现ESRPs与EMT过程密切相关。多种研究显示在敲除或过表达ESRPs细胞中，受影响的功能途径存在大的重叠。具体而言，众多研究的途径分析一致证明，主要涉及细胞黏附，细胞迁移运动和细胞骨架调节三方面，这些都是特征性地区分上皮细胞和间充质细胞的途径[6]。ESRP靶向的大多数转录编码蛋白具有上皮细胞功能，但是还不清楚ESRP诱导的上皮剪接变体是如何调节上皮表型的。最近相关研究进展表明，这些上皮剪接变体类似于FGFR2，是通过各种机制对上皮细胞功能发挥着重要影响。

2.1 影响细胞黏附的上皮剪接蛋白变体 p120-Catenin：成熟的基于E-钙黏蛋白的黏附连接点是上皮细胞的主要标志，作为钙黏蛋白-连环蛋白复合物的一部分，p120-连环蛋白与钙黏蛋白的细胞质结构域结合，并且通过内吞作用和蛋白酶体降解来阻止其下调，从而作为钙黏蛋白稳定性和功能的主要调节剂[7-9]。p120-连环蛋白的其他功能包括调节Rho-GTP酶信号传导和转录调节，特别是充当了Wnt信号传导通路的调节剂[10，11]。编码p120-连环蛋白的人CTNND1基因具有四个不同的翻译起始位点和四个可变剪接的外显子。目前区分的最相关的剪接变体是含有替代外显子2和3的相对长的间充质特异性剪接变体。间充质p120变体的异常表达与癌症进展有关，可能是通过核信号传导或通过影响Rho-GTP酶信号传导的机制[10，11]。有研究发现p120-连环蛋白的长间充质异构体可以促进MDA-MB-231细胞的侵袭性，这依赖于它们抑制RhoA活化的能力[12]。

CD44：CD44蛋白是普遍表达在跨膜细胞的表面蛋白。CD44的细胞外结构域主要作为细胞外基质分子透明质酸的受体起作用，并且具有其他ECM组分和细胞表面受体的其他结合位点。CD44的细胞质结构域与肌动蛋白细胞骨架间接相关，并介导其信号功能，从而控制细胞-细胞和细胞-基质黏附，细胞迁移、运动和信号传导[13]。AS可以产生多种CD44 mRNA转录物。外显子1-5和外显子16-20通常拼接在一起，并编码标准CD44s蛋白异构体。另外包含10个可变中间体外显子产生多个较长的可变剪接CD44蛋白异构体，命名为CD44v1-10[13]。较长变体形式的CD44具有延伸的细胞外茎结构域，它具有高度糖基化并提供额外的配体结合位点[13，14]。包含外显子变体与癌症进展相关。虽然包含一些变体外显子，特别是CD44v4-5和CD44v6增加了转移能力，但是v8-10的包含对于正常上皮细胞是典型的并且与E-钙黏蛋白表达相关[14]。CD44v8-10和CD44v1-2取决于ESRP1活性[15]。由于ESRP1的丧失和切换回CD44s表达而排除这些外显子对于EMT发生是至关重要的[15]，这表明ESRP部分地通过抑制CD44抑制EMT过程。

Integrin-α6：整联蛋白是参与细胞基质附着的异二聚体跨膜糖蛋白。目前，已经鉴定了18个α亚基和8个β亚基，其可以形成异二聚体[16]。层黏连蛋白结合α6整联蛋白亚基与β1整联蛋白结合形成α6β1整合素，它和β4整联蛋白在许多细胞类型中被发现，常见于上皮细胞，其中α6β4整联蛋白是半桥粒的一部分。α6整联蛋白基因ITGA6的外显子25的AS产生两种剪接变体α6A和α6B。最近，它显示包含外显子25，导致α6B的较长细胞质结构域，由ESRP1介导α6A和α6B剪接变体在胚胎发育过程中具有不同的功能和表达谱[17]。成人结肠上皮也显示差异表达，因为α6B由静止分化细胞表达，而α6A在增殖细胞中被发现[18]。结肠癌与表达α6A的细胞增加相关，其通过涉及α6A激活Wnt信号传导途径的机制导致肿瘤增殖增加[18]。尚不清楚它是否促进α6整合素向β1转化，比如在乳腺癌干细胞中，ESRP1介导的α6整合素剪接的丧失可能促进α6Aβ1异二聚化并导致肿瘤形成[17]。

2.2 影响转移和侵袭的上皮剪接蛋白变体 MENA：MENA是肌动蛋白调节剂Ena/VASP蛋白家族的成员。它是一种细胞内支架蛋白，调节片状伪足，丝状伪足,细胞-细胞连接和黏着斑中肌动蛋白丝的聚合，并参与调节细胞形态，细胞骨架排列和细胞运动。与相关家族成员ENA和VASP相反，目前已经在人类中发现了几种甲型谷胱甘肽的AS异构体[19]。除了普遍表达的人MENA(hMENA)之外，人肿瘤细胞通常表达在正常组织中未发现的一种或多种剪接变体。其中，以跳过的外显子6命名的hMENAΔv6与包含外显子11a变体命名的hMENA11a互斥，hMENA11a的表达受ESRP1调节[20，21]，并与E-钙黏蛋白表达和减少的侵袭相关，与其在上皮细胞中的特异性表达一致，与间充质细胞相反。有趣的是，两种剪接变体在同一肿瘤中表达不同，在乳腺癌研究中，发现表达hMENA11a的细胞构成原发肿瘤的大部分，而侵袭性肿瘤细胞表达hMENAΔv6[22]，这些发现表明，hMENA AS中的ESRP1依赖性转换控制着肿瘤细胞的侵袭。实际上，最近的研究强调了hMENAΔv6可能用作非小细胞肺癌和乳腺癌的预后生物标志物[19，23]。

Exo70：Exo70是一种八聚体蛋白复合物，与调节上皮细胞的胞吐作用和顶端 - 基底极化有关。Exo70至少有五种可变剪接的异构体[24，25]。在这些异构体中，Exo70-E表达受ESRP1控制并且是上皮特异性的，而Exo70-M存在于缺乏ESRP1的间充质细胞中。这些异构体具有不同的功能，仅有Exo80-M结合Arp2/3复合物，从而促进肿瘤细胞的侵袭。有趣的是，在间充质细胞中引入Exo70-E不仅可以抑制细胞侵袭，还可以通过一种可能依赖于抑制EMT-TF Snail的机制来获得上皮表型[25]。据报道，Exo70还可通过结合剪接体直接调节其自身的剪接，尽管这涉及Exo70-E和Exo-70M之间共有的结合区域[24]。然而，这些研究表明由ESRP诱导的Exo70变体可能作为上游潜在的反馈调节剂起作用。

3 ESRP剪接变体调节EMT过程

虽然有充足的证据表明ESRP通过EMT相关信号通路调控上皮细胞的剪接事件，但是ESRP的表达是EMT过程的继发结果，还是与EMT相反，是一种相对独立的选择性转录后程序，目前尚不清楚。可以明确的是，下调ESRP1和ESRP2是EMT作用的结果，该过程由EMT-TFs诱导产生[15，20，26]。

在人乳腺上皮(HMLE)细胞系中，通过他莫昔芬诱导Twist ER的表达，14天内完成Twist诱导的EMT过程，包括E-cadherin的缺失，N-cadherin的获得，以及成纤维样细胞的形成。RNA序列分析发现Twist-ER诱导HMLE细胞系中EMT显著降低ESRP的表达，并导致大约1500个AS的改变[15，26]。其中，约8%与外显子跳跃事件重叠，这些事件在先前研究中归因于ESRPs[26]。虽然这些结果可能表明ESRP和EMT控制不同的程序，但是EMT和ESRP调控AS之间的相互作用还需进一步探索。

有实验证据表明，敲除上皮PNT2细胞系中ESRP1和ESRP2基因，可以诱导间充质标志物的形成如波形蛋白，纤连蛋白，MMP-2和N-钙黏蛋白，并降低E-钙黏蛋白在质膜的定位[21]。有趣的是，MDA-MB-231细胞中ESRP1和ESRP2的表达可引起E-钙黏蛋白升高，而不影响N-cadherin或纤维连接蛋白[27]，表明ESRP可能通过不同的机制影响E-钙黏蛋白的表达，不同于ESRP诱导的蛋白质异构体对EMT的上游调节。最近有头颈部鳞状细胞癌细胞(HNSCCs)的研究表明，ESRPs可以在EMT中扮演互补角色。ESRP1控制促进运动的Rac1剪接变体Rac1b的AS[28，29]，ESRP2则通过另外一种不同的机制下调E-钙黏蛋白的表达。ESRP2降低E-钙黏蛋白的机制涉及EMT-TF SIP1，该过程可下调E-钙黏蛋白转录[29]。目前对ESRP2如何调控SIP1及其转录和转录后机制尚不清楚[29]。

改变细胞标记物如E-钙黏蛋白的表达可以诱导EMT程序，导致细胞形态和细胞迁移能力的改变[6]。因此，细胞功能实验检测ESRP1/ESRP2敲除或过表达对细胞形态和细胞迁移的影响结果发现，同时敲除ESRP1和ESRP2，或只敲除ESRP1，HMEC细胞形态发生改变，即纺锤形细胞增加，鹅卵石样细胞以及细胞-细胞黏附减少。此外，划痕实验中，同时敲除ESRP1和ESRP2，或只敲除ESRP1可以促进细胞迁移[21]，Ishii等[29]在HNSCCs(SAS和HSC-4)研究中同样证明了这一点。在HMLE-Twist细胞中过表达ESRP1后，迁移特征改变为在单层上皮细胞中的常见类型[26]。在调查对肌动蛋白细胞骨架的影响时，观察到敲除ESRP1可促进丝状伪足的形成，而ESRP2并没有。这表明ESRP1和ESRP2是以不同方式抑制细胞运动：ESRP1通过细胞骨架作用，而ESRP2是通过细胞-细胞黏附方式。

4 ESRPs和肿瘤形成

在肿瘤形成过程中，AS和可变蛋白异构体一样，可以促进肿瘤癌蛋白的形成。AS被认为肿瘤的标记物[8，30]，可以影响多个过程，包括通过表达端粒酶hTERT较短的亚型来促进复制，通过EGFR受体的可变剪接促进肿瘤的持续增殖信号的传导[31]。AS介导的促癌过程的其他特征包括逃避生长抑制因子，减少细胞凋亡，细胞代谢失调和侵袭、转移等[8]。

肿瘤形成与分化上皮的特征缺失有关，这与ESRPs在肿瘤形成中的作用类似，实际上，在多个肿瘤细胞系中，例如来自前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、肾癌、头颈部鳞状细胞癌的转移性肿瘤细胞系中，细胞和肿瘤组织的侵袭与ESRP1和2的低表达有关[27，28，32，33]，表明了ESRPs的肿瘤抑制功能。这一观点得到了相关研究的进一步支持，有研究表明ESRP1过表达在体外减少了胰腺癌细胞的迁移和增殖，在体内很少产生肝转移[33]。此外，临床数据显示ESRP1表达水平与透明细胞肾细胞癌和乳腺癌中的患者存活率正相关[32]。在原发性结肠肿瘤微卫星转移灶中，发现50%的ESRP1基因突变，体外实验敲除ESRP1可以抑制癌细胞生长，表明ESRP1是结肠癌的肿瘤抑制因子[34]。

与之相反，ESRP1高表达和由此产生的CD44v8-10剪切变体与4T1小鼠模型和乳腺癌患者更高肺转移相关[35]。ESRP1诱导的剪接变体CD44v8-10有稳定胱氨酸转运蛋白xCT(SLC7A11)的能力，同时增加细胞对活性氧的抵抗力，使其具有潜在的致癌功能[35]。乳腺癌细胞缺氧也会引起ESRP1表达增加，促进向间质表型的转化，但具体机制有待明确。ESRP1可促进多个乳腺癌细胞系对抗癌剂苯基丁酸酯(一种组蛋白脱乙酰基酶拮抗剂)的敏感性，因此，ESRP1降低了对化学抗性有确定作用的基因表达，例如AXL，IFI16和CAV1[36]。

关于ESRP2在肿瘤形成中的作用研究较少。在大多数透明细胞肾细胞癌患者中，ESRP1和ESRP2均有肿瘤抑制功能，但是作用机制不同。在这些肿瘤中，ESRP1 mRNA表达显著下降，ESRP2 mRNA表达趋于稳定，但是由于Arkadia功能丧失降低了剪接活性，其促进了ESRP2诱导的剪接[37]。在HNSCCs中也报道ESRP1和ESRP2的调节，其中ESRP1通过Rac1剪接调节细胞运动[29]，而ESRP2影响细胞-细胞黏附，有数据表明ESRP1 mRNA表达水平受缺氧条件影响，而ESRP2不受影响。总之，大部分研究表明ESRPs具有肿瘤抑制作用，也有研究发现ESRP1有肿瘤保护作用，因而ESRP1和ESRP2的调控机制及其功能并不完全一致。