患者来源肿瘤异种移植模型的建立与应用

傅佳琦 滕理送 王浩浩

癌症是一种高度异质性的疾病，其特征是多种遗传损伤和信号通路异常。尽管新型治疗方法不断发展，但对于肿瘤晚期患者来说，如何解决化疗耐药性和延长总生存期仍然是重大挑战，迫切需要更有效的治疗方法。临床前模型是从对疾病的生物学理解到开发新的治疗方法过程中的重要组成部分。通过人类恶性肿瘤细胞系建立的异种移植模型是抗肿瘤药物研发中常用的体外平台[1]，这种临床前模型方便易用，在研究导致肿瘤发生的分子事件中具有重要价值，但在临床前药物的开发上有着明显的局限性。例如在长期离体培养过程中，细胞会发生一系列重大和不可逆的生物学特性改变[2]。为克服这些限制，一种更先进的肿瘤模型即患者来源异种移植（PDX）模型应运而生：将患者的肿瘤组织标本直接移植到免疫缺陷小鼠体内，在没有离体培养的情况下进行传代。与离体培养细胞相比保留了更多的原发肿瘤特征，在筛选药物、鉴定生物标志物、个性化治疗研究中有重要的应用价值，现综述如下。

1 PDX模型的建立和验证

建立PDX模型需要将患者肿瘤组织或细胞直接植入于免疫缺陷小鼠体内，免疫抑制更严重的小鼠如非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺陷（NOD/SCID）或NOD/SCID/IL-2λ受体缺失（NSG）小鼠植入率较高[3]，更适合生成PDX模型。PDX模型可分为异位植入和原位植入两类。异位植入是指将肿瘤碎片或单细胞悬液植入与原始肿瘤部位无关的区域，通常是皮下或肾包膜下，该植入方法简单、监测肿瘤大小更准确，特别适用于需要在短时间内大量移植的情况。此外，也可将患者肿瘤组织移植到与原始肿瘤相同的器官内，即患者来源原位异种移植（PDOX）模型，其优势在于肿瘤可以在相同的解剖微环境中生长，但操作过程复杂，费用更高。建立模型通常需要2～4个月，若6个月仍未观察到肿瘤生长，则表示移植失败[4]。将从患者体内获取的肿瘤组织切成1～2mm3大小的碎片，置于冷冻培养基中保存。接受肿瘤碎片的第一代小鼠通常表示为F0或G0，当肿瘤达到足够的大小时，将其解剖并重新植入其他小鼠体内。此后的每一代被命名为 F1，F2，F3…Fn 或 G1，G2，G3…Gn。为避免PDX模型在传代过程中与原始肿瘤产生分化，通常第三代（即F3或G3）被用于药物疗效评估[5]。当移植肿瘤达到一定大小（直径1～2cm）时便可将周围正常组织一并切除，经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋后切片行HE或免疫组化染色，以便验证其组织学是否与原发肿瘤一致。从冷冻组织中提取肿瘤DNA、RNA、蛋白质可用于全基因组测序、特定基因及蛋白质表达的检测。

模型的移植成功率受到肿瘤的组织学亚型、侵袭性特征和植入部位等多种因素的影响。例如，在乳腺癌中，三阴性乳腺癌的移植成功率高于其他组织学类型[6]。此外，转移性肿瘤比原发性肿瘤移植成功率更高[7]。由于肾包膜保留了原始肿瘤基质和等效的宿主基质，肾包膜内植入的成功率要高于皮下植入[8]。值得注意的是，肿瘤标本对宿主环境的适应能力不同于原发肿瘤，若能适应环境而不产生免疫排斥反应，则更有可能成功。

2 PDX模型在肿瘤研究中的应用

2.1 PDX模型的特征 目前已成功建立乳腺癌[9]、胃癌[10]、结直肠癌[11-12]、卵巢癌[13-14]、肺癌[15-16]、头颈部鳞状细胞癌[17]、胶质母细胞瘤[18]、黑色素瘤[19]等多种恶性肿瘤的PDX模型，这些模型可在没有离体培养的情况下进行传代，肿瘤细胞生长在类似于患者原发肿瘤部位的氧、营养和激素水平的微环境中，因而可保留其供体肿瘤的大部分组织病理学、生物学、遗传学特征和表观遗传异常等关键特征。例如，结直肠癌的PDX模型保存了原发肿瘤的组织病理学特征、基因拷贝数变异率，并检测到与原发肿瘤相一致的KRAS、NRAS、BRAF和PI3K突变状态，且在传代后保持稳定[11]。有研究比较不同传代的头颈部鳞状细胞癌PDX模型对西妥昔单抗治疗的敏感性反应，结果表明几代间保持稳定的应答[17]。其次，PDX模型在药物疗效、生物标志物分析的研究中表现出与原代肿瘤相似的结果，显示出较高的预测能力，进一步体现其在肿瘤研究中的价值。

2.2 药物筛选和生物标志物开发 抗癌药物开发的主要问题之一是新药成功率低，仅5%的临床前抗癌药物最终被批准用于临床治疗[20]。这可能与筛选新药物的传统临床前模型的预测价值低和缺乏合适的用于选择患者和监测治疗反应的生物标志物有关。PDX模型的应用可能改变这一现状。

越来越多的证据表明，无论是靶向药物还是经典细胞毒药物，PDX模型的药物应答率与临床结果相近。例如，对BRAF V600E突变型结直肠癌PDX模型进行分析，评估选择性BRAF抑制剂达布拉非尼与选择性MEK抑制剂曲美替尼联合治疗的疗效，结果与提供肿瘤标本的患者数据一致[12]。又如，化疗相关研究中也显示出PDX模型与临床相一致的反应率[21]。此外，PDX模型还可作为潜在的临床药物筛选平台。在PDX模型中，二甲双胍无法抑制胰腺癌生长，同样，临床试验也表明在局部晚期和转移性胰腺癌的联合治疗方案中加入二甲双胍没有任何益处[22]。提示肿瘤患者对药物的阴性临床结果也可通过PDX模型来预测，从而节省临床试验所需的时间和资源。

除确定潜在的临床适应证外，PDX模型还有助于鉴定潜在的生物标志物。在乳腺癌PDX模型中，黏附分子nectin-4可作为原发性和转移性三阴性乳腺癌的特异性有效治疗靶点，同时也可作为新的乳腺癌预后不良标志物[9]。药物敏感性和耐药性的生物标志物可能有助于设计联合临床试验。在胶质母细胞瘤PDX模型中，DNA修复基因甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（MGMT）启动子超甲基化可显著提高替莫唑胺对胶质母细胞瘤的疗效，被用作评价替莫唑胺和聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（PARP）抑制剂维利帕尼（veliparib）联合治疗胶质母细胞瘤的生物标志物[18]，已纳入Ⅱ/Ⅲ期临床试验。在BRAF V600E突变型黑色素瘤PDX模型中，发现多种类似于应用BRAF抑制剂治疗过程中的临床数据中所确定的耐药途径，而MEK抑制剂的加入可克服其对单药BRAF抑制剂产生耐药性[19]。基于这些数据，PDX模型可在药物研究中发挥重要作用，以帮助选择最可能对新药物敏感的患者群体，确定合适的生物标志物，以便纳入临床研究。

2.3 PDOX模型对于恶性肿瘤转移研究的应用价值 研究表明，大多数人实体瘤在裸鼠皮下植入后不会发生转移，而PDOX模型可以重现原发肿瘤的局部侵袭性生长和转移行为，比PDX模型更好地再现人类肿瘤行为[23]，通常用于建立转移性肿瘤模型，包括将原发肿瘤碎片原位移植等待移植瘤生长产生自发转移[23]，或将转移灶直接作原位移植[24]。

PDOX模型中生长的原发肿瘤和转移性肿瘤药物敏感性可能不同，这在皮下移植肿瘤模型中是无法检测到的。例如，HER-2阳性宫颈癌的裸鼠皮下PDX模型和PDOX模型对苯甲酰胺组蛋白脱乳糖酶抑制剂eninostat均不敏感，但在PDOX模型中观察到该药与对照组相比明显降低了转移性肿瘤的负荷[25]。PDOX模型通过保留肿瘤的微环境，更好地反映肿瘤转移的生物学过程，可用于基质在肿瘤治疗过程中的作用、肿瘤转移的机制、转移性肿瘤药物反应等相关临床研究[26]，对恶性肿瘤转移的精准治疗具有重要意义。尽管如此，PDOX模型仍然相对罕见，可能是因为缺乏器官特异性移植所需的精细显微外科手术以及合适的用于监测肿瘤进展的影像学技术，未来需要进一步研究。

2.4 共临床试验 为实时整合和分析小鼠模型与患者之间的信息，研究者提出“共临床试验（co-clinical trial）”的概念[27]。该试验是指临床前试验与临床试验同时进行，对相关的临床、生物学和药理学信息进行全面分析并进行整合，以确定对特定治疗反应的预测生物标志物。这些研究在最初是将基因工程小鼠模型对药物的结果应用到临床试验，并在急性早幼粒细胞白血病的治疗中得到验证[27]。目前，PDX模型已经被用于临床试验的平行研究中，以研究药物应答与耐药机制、研发提高药物疗效和抗耐药的治疗策略以及筛选预后生物标志物。Kim等[15]的一项共同临床试验中，PDX模型忠实复制了肺鳞状细胞癌患者对多激酶抑制剂多维替尼(dovitinib)的临床反应，并确定FGFR基因的表达是预测肺鳞状细胞癌对该药疗效的敏感性生物标志物。共临床试验不仅是为了预测正在进行的人类临床试验的结果，而且也是为了产生能够为人类研究的分析和设计提供依据的临床相关假设。例如，Owonikoko等[16]的一项研究三氧化二砷治疗复发性小细胞肺癌的疗效的试验中，PDX模型与Ⅱ期临床试验中的结果相一致。这些研究支持在患者接受临床试验前使用PDX模型预先筛选有前途的抗癌药物，以节省药物开发的时间，取得更有效的临床成果。

2.5 个性化治疗 肿瘤被认为是一种由遗传变异累积而引起和驱动的疾病，几乎每种肿瘤都有其独特的分子变化。个性化PDX模型即Avatar小鼠模型已被用于个性化的癌症治疗[28]。其理论基础来自于肿瘤患者对治疗方案的不同敏感性以及上述PDX模型中药物应答与临床反应之间存在的显著相关性[13-14]。研究人员对晚期实体肿瘤患者进行外显子测序，通过建立Avatar模型来鉴定肿瘤的药物靶点并筛选药物，并为每例患者确定最佳的治疗方案[28]。当基因组分析提供的信息较少或靶向途径失败时，Avatar模型有助于选择更多的常规药物及药物组合。尽管在效率、速度和成本方面存在局限性，但目前的数据支持使用个性化肿瘤移植模型作为治疗决策的研究平台。

3 PDX模型的局限性

近年来，PDX模型因其独特性在癌症研究领域取得了重要进展，但仍存在一些局限性。第一，模型建立时间较长，限制了在预计生存期较短的患者中的应用。Mini-PDX模型提供了一种有效的替代方案，将原始肿瘤标本以肿瘤细胞悬液的形式转移到洗涤胶囊中并埋于裸鼠皮下组织内，只需7d就可以完成药物敏感性测试[29]。第二，小部分PDX模型与原代肿瘤组织存在分化差异[10]。此外，连续传代过程中，小鼠基质逐渐取代人类基质，可能导致肿瘤旁分泌调节和间质压力等物理性质的改变，继而限制与肿瘤微环境相关药物的研究[30]。第三，模型长期保存比较困难，需要建立有效的长期冷冻保存条件以及提高后续再移植效率。已有研究表明特殊冷冻保护剂显示出较传统介质更优越的性能，可缩短肿瘤形成时间和收获时间，将再生移植率提高近3倍，即使是超过3年的长期冷冻储存也能成功地再移植，并可将模型因低温保存而丢失的潜在风险减少4倍[31]。这一领域的未来研究应该致力于确定安全可靠的冷冻保存时间的上限。第四，模型易受微生物感染。淋巴增生性病变的高发生率是由于动物模型的免疫缺陷性质引起的，多与EB病毒感染相关[7]。移植瘤被淋巴增生性病变取代，两者大体外观上很难区分，因此，在传代之前检查移植物的组织学非常重要。第五，由于小鼠的免疫缺陷性质，传统的PDX模型不适用于疫苗和检查点阻断抗体等免疫调节剂的筛选。人源化小鼠模型[26]或基因工程小鼠模型可以作为一种替代选择。第六，PDX模型药效评价系统有待完善。在治疗过程中肿瘤生长迟缓通常会导致肿瘤体积在终点大于治疗前而小于对照，虽然这很可能表明治疗是具有生物活性的，但这并不意味着该疗法在临床上有效；事实上，这种反应在临床上被定义为“疾病进展”，甚至是“疾病稳定”[26]，需要使用定量指标对反应进行分类以便更精确地评估试验中的治疗效果。有研究者提出改良评价标准[32]，将反应速度、强度和持久性相结合，进一步统一解读治疗反应。第七，虽然PDX模型具有上述多种优点，但建立和维持该类模型为基础的肿瘤精准医学需要高成本和大量人力资源，这就需要充足的后勤保障，目前已创建和实施共享包括欧洲EurOPDX资源、美国国家癌症研究所（NCI）的患者模型存储库、异种移植公共存储库（PRoXe）等大规模PDX模型平台[26]，这些多机构平台依赖于共同的、经过广泛测试的操作程序，得到大量资金的支持，确保了可扩展、同质和可重复的实验方案。

4 小结

总之，PDX模型保留了患者肿瘤的基本特征，在肿瘤研究领域中有重要用途。这一模型在药物筛选、生物标志物，共临床试验中具有许多优势，可作为制定个性化医疗策略的临床前研究工具。此外，PDOX模型对于恶性肿瘤转移研究具有价值。然而，目前仍有一些关键问题需要解决，设法提高模型移植成功率、加快生成速度、完善长期保存条件、减少微生物感染、完善药效评价系统、提高在基质及免疫系统相关研究方面的应用等有助于发挥其巨大的发展潜力，成为临床肿瘤学研究领域的主流模式。