modRNA技术：一种蛋白表达新方法

颜冰倩 综述 付炜 审校

【提要】 早在上世纪90年代，注射裸信使核糖核酸（mRNA）已经能够在体内实现外源性蛋白的表达。然而，mRNA的不稳定性及高度免疫原性阻碍了这项技术的进一步发展与应用。近年来，随着对mRNA结构的认识深入及核酸技术的进步，可化学合成并修饰信使核糖核酸，即Chemically synthetic modified message RNA（modRNA），modRNA兼具稳定性、低免疫原性及良好的蛋白翻译表的优势。我们对其研究现状、存在问题进行综述，并对可能的改进方向进行展望。

化学合成修饰信使核糖核酸（Chemically Synthetic Modified Message RNA，modRNA）是指利用化学修饰的碱基在体外合成mRNA，为一种新型的基因载体。该技术以不同修饰的碱基为原料，将含有mRNA生物信息的DNA片段进行体外转录以合成modRNA，再经由脂质体或纳米颗粒等介质转入靶细胞中进行蛋白质的翻译表达，从而实现体内外快速、高效、脉冲式地表达具有生物活性的目标蛋白，以达到治疗疾病的目的。

1 modRNA的结构

modRNA通常由5个部分构成，分别是5'-帽结构 （5'-Cap）、5'-非编码区（5'-Untranslated Region，5'-UTR）、开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）、3'-UTR 和 3'-多聚腺苷酸尾（3'-PolyA Tail）。上述五个部分各司其职，缺一不可：5'-Cap控制翻译起始，提高翻译效率；5'-UTR及3'-UTR利于与配体结合，保证翻译的顺利进行；ORF为mRNA的编码序列，并采用不同修饰的碱基替代正常的A/U/C/G，从而提高其稳定性及表达效率；3'-PolyA Tail则可通过调节长度来进一步控制mRNA的稳定性及降解速率[1]。

2 modRNA的发展历程

早在1990年，有研究发现向小鼠体内注射裸mRNA能够实现外源性蛋白的表达。尽管如此，区别“自我”与“非我”的能力是机体识别病原体RNA并发挥免疫应答的基础，体外转录的mRNA能够结合并激活膜受体Toll样受体（Toll-like Receptors，TLR）[2-3]及胞内受体视黄酸诱导基因蛋白 I（Retinoic Acid-Inducible Gene I，RIG1）[4]、黑色素瘤分化相关分子 5 （Melanoma Differentiation-Associated Protein 5，MDA5）[5]等受体，从而刺激机体产生大量炎症介质并启动级联免疫效应以清除这种外源性mRNA。总之，这种先天性免疫反应的激活不但会影响mRNA在胞内的翻译表达、加速其剪切及降解，甚至会诱导细胞的凋亡以及组织的结构或功能的损害，造成严重的副作用[6]，从而使得该技术的发展与应用受到限制。

病原微生物和线粒体的RNA几乎不含修饰的核糖核苷酸，而真核生物天然存在多种碱基修饰方式。研究表明，经碱基修饰的modRNA不但能显著降低体外转录mRNA的免疫原性，减少相关炎性因子的产生、抑制细胞毒性、提高细胞存活率，还能大大增强其在细胞内外的稳定性和翻译表达能力，从而更高效、更持久地表达所需的目的蛋白[7-10]，为基因治疗开拓了新思路，并提供了新的方法。Hornung等[4]及Karikó等[7]率先利用含 5-甲基胞嘧啶（m5C）、6-甲基腺嘌呤（m6A）、5-甲基尿嘧啶（m5U）、2-硫尿嘧啶（s2U）和假尿嘧啶（pseudouridine，ψ）等修饰碱基的核糖核苷酸在体外转录合成modRNA，模拟真核细胞自身的RNA结构，转染靶细胞后能够抑制TLR3/TLR7/TLR8及RIG-1等受体的活化，减少TNF-a、IL-12等炎症因子和CD80、CD86等免疫共刺激因子的产生，显著降低了mRNA的免疫原性和细胞毒性。此外，Anderson等[8-9]发现ψ-modRNA能够通过抑制双链RNA依赖性蛋白激酶（Double-Stranded RNA-Activated Protein Kinase，PKR）及 2'-5'寡聚腺苷酸合成酶（OAS）的活化来提高自身的稳定性，并促进目的蛋白的翻译和表达，使得体外合成高质量、稳定且免疫原性低的mRNA成为可能。

不同的碱基修饰方法能够影响modRNA的免疫原性及翻译表达能力。因此，对modRNA修饰碱基的研究及改进或许能够实现调控免疫应答强度及蛋白表达效率的目的。有研究表明，ψ/m5C-modRNA能够显著提高蛋白翻译功能，而m6A/s2U-modRNA 虽免疫原性极低，但转录效率也低[7，10]，因而ψ/m5C-modRNA似乎更适合作为基因表达的载体而被广泛报道。2015年，Andries等[11]报道了一种新的碱基修饰方式N1-甲基假尿嘧啶（N1-methylpseudouridine，m1Ψ），并证明了m1Ψ-modRNA在蛋白表达和免疫原性方面均优于以往的Ψ-modRNA。因此，随着对新的碱基修饰的不断发现和功能研究，将来会有更多种类的修饰碱基用于制备出翻译效率更高、表达效果更好、更为稳定的modRNA。

3 modRNA的优势

与传统的质粒或病毒基因载体相比，modRNA具有其独特的优势。由于modRNA进入细胞后无需入核，不依赖细胞的增殖分裂就能发挥作用，因而能够迅速在各类细胞内翻译产生目的蛋白，随后遵循核糖核酸正常的代谢途径进行降解，由于modRNA为单链的RNA，因而整合到宿主基因组的风险非常小，具有极高的安全性[1，12]。同时，modRNA具有良好的可控性，通过调整modRNA的转染剂量、次数、部位等能够较好地控制蛋白表达的量、时长及位置，实现短时间、脉冲式地表达所需的目的蛋白。此外，结构改造和碱基修饰的modRNA具有良好的稳定性、低免疫原性、高效的蛋白翻译能力[8，10-11]。而且，同一种modRNA只需要一个DNA模板，更容易实现低成本、高产量、高效能的工业化生产。

4 modRNA的应用

正是由于mRNA在生物中心法则中扮演的独特角色，并具有传递遗传信息、表达目的蛋白的承接作用，modRNA技术已迅速成为各领域研究和应用的热点。

4.1 modRNA与体细胞重编程

因modRNA在机体生长发育、建立疾病模型及细胞自体疗法中的独特优势，诱导性多能干细胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）一直是各领域研究的热点。2010年，Warren等[13]开创性地体外合成表达Oct4/Sox2/c-Myc/Klf4这4个转录因子的5mC/ψ-modRNA，并将其共同导入多种人体细胞中，最终诱导产生具有全能性的iPSCs，这为重编程及定向分化研究提供了一种全新且安全可靠的方法。2016年，Luni等[14]通过自动化的微流控系统进一步优化了体细胞重编程的微环境，增强了细胞自身及细胞间的自分泌及旁分泌作用，2周时间即可产生纯度高、均一性好的iPSCs，兼具成本低、远程控制等优点，为该技术更好地应用于基础研究、疾病治疗奠定了基础。值得注意的是，对比逆转录病毒，modRNA诱导的iPSCs在转录水平更接近于ESCs，这可能与modRNA技术不改变细胞的遗传性状有关。

4.2 modRNA与组织再生

在体内外研究中，通过瞬时、高效、脉冲式地表达具有生物活性的旁分泌因子，modRNA能够有效调控靶细胞的分化、增殖，促进损伤后组织或器官结构及功能的恢复，故可作为组织修复与再生的一种有效治疗手段，尤其在心肌再生[15-20]与骨修复[21-23]方面的报道较多。2013年，Lui等[16-17]率先利用编码VEGF的modRNA，促进心脏祖细胞向血管内皮细胞分化，从而有助于心肌细胞的增殖及存活，与DNA质粒相比，其在减少心梗范围、改善血供及加快心功能恢复方面效果更好，因而具有良好的临床应用价值。2018年，Carlsson等[15]进一步利用N1ψ-modVEGF在大型动物体内验证了modRNA技术在治疗心血管疾病方面的可行性。此外，有研究表明，心梗早期注射 modIGF1（胰岛素样生长因子 1，Insulin-like Growth Factor 1）有利于心肌细胞的存活，进而能够有效地改善心梗的预后情况[18]。但Zangi等[19]利用modRNA技术筛选刺激心外膜脂肪组织形成的旁分泌因子，发现IGF1R信号通路的激活能够促进心外膜祖细胞向脂肪细胞分化，导致心外膜下脂肪组织沉积，可能诱发心律失常等心血管疾病，故modIGF1在心梗治疗的应用尚需充分评估、权衡利弊。

骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins，BMPs）这类细胞因子在调控骨骼生长发育及促进骨修复再生中具有重要作用。modRNA作为一种高效、安全的基因替代技术，在该领域的潜在应用价值也逐渐受到了认可，近年来多篇文献报道，modBMP-2和modBMP-9结合纳米载体能够有效修复骨缺损，在骨再生中具有巨大的临床转化前景[21-23]。

4.3 modRNA与基因治疗

迄今为止，各种基因载体在基因缺陷疾病的替代治疗和目的蛋白的过表达领域中均取得了显著成果，modRNA能够转染细胞并高效、快速地表达编码蛋白，随后被降解清除，不在基因组中留下任何痕迹，这些特征使得该技术在体内外基因替代的研究及治疗中具备独特的优势。在体外研究中，Wang等[24]通过病人来源的iPSCs构建组织工程心脏补片，经shRNA及crispr/cas9等基因编辑技术敲低或敲除Tafazzin基因（TAZ）来构建巴氏综合征（Barth syndrome，BTHS）疾病模型，最后利用modRNA技术过表达TAZ来逆转疾病的进程，以此探索疾病发生发展的病理生理过程，并为临床药筛提供依据。在体内治疗中，肺表面活性蛋白-B（surfactant protein B，SP-B）缺陷症是由于机体肺泡Ⅱ型上皮细胞产生SP-B不足引起的一种致死性肺部疾病。2011年，Kormann等[25]让SPB缺陷的小鼠模型吸入modSP-B，发现能够有效弥补小鼠体内SP-B的缺失，改善呼吸系统的不良症状，显著提高生存率。此外，modEPO（促红细胞生成素，Erythropoietin）作为基因治疗的另一代表性成果，多项研究均表明，与未修饰的mRNA相比，modRNA能够显著提高mRNA的稳定性，抑制机体免疫应答的激活，进而实现更高水平、更长时间的EPO的表达，从而更有效地提高血液中红细胞水平[26-27]。由此可见，modRNA在疾病发展过程及基因替代性治疗的研究中均卓有成效。

4.4 modRNA与疫苗

mRNA作为一种安全高效的基因载体，能够编码病毒相关抗原，激活机体免疫系统，进而保护宿主免受病毒侵害，是一种新兴的疫苗形式。未经修饰的mRNA能够有效激活机体的固有免疫反应，增强宿主的抗病毒免疫应答，但也会因其具有的强免疫原性而影响疫苗翻译表达，最终影响mRNA疫苗的疗效。因此，modRNA可能是一种良好的疫苗载体。同时，与减毒或灭活的病原体疫苗、DNA疫苗、蛋白或多糖疫苗对比，modRNA疫苗具有更好的安全性、更优的药物稳定性或更低的生产成本，便于临床转化应用。此外，modRNA疫苗能够根据患者机体的免疫情况，通过调控编码区来控制免疫应答强度及特异性，从而达到精准、个性化的计划免疫的目的。2017年，Nature和Cell均发表了modRNA疫苗在抗zika病毒中应用的报道，modRNA编码信号肽、zika病毒的前膜蛋白和包膜蛋白后，能够在宿主体内自组装成具有免疫原性而无感染能力的病毒样颗粒，进而激活免疫系统产生特异性免疫应答，最终实现保护小鼠甚至灵长类动物较长时间免受zika病毒感染及损害的目的[28-29]。

此外，随着肿瘤疫苗研究的兴起，modRNA疫苗在肿瘤免疫治疗中的作用也逐渐引起了人们的关注，Sahin等[30]及Stadler等[31]利用modRNA编码个体化突变的多个新表位或双特异性T细胞诱导抗体，成功招募并激活T淋巴细胞介导的特异性免疫应答，从而达到抑制甚至清除肿瘤的目的。modRNA肿瘤疫苗不仅能够实现肿瘤治疗的个体化，还能够通过重复注射、持续表达的方式增强抗肿瘤的疗效，或许是肿瘤免疫治疗的一种新兴策略。

5 展望

与未修饰的mRNA相比，虽然modRNA在蛋白表达及免疫原性方面均有明显的改进，但是如何实现其在体内的靶向传递是未来临床转化中需要解决的难题之一。modRNA在体内发挥生理功能，不仅涉及如何逃避肝肾的代谢、单核巨噬系统的清除及核糖核酸酶的降解从而有效地向特定组织靶向传递，还涉及如何克服mRNA的体积及电荷屏障以最大程度地被细胞吸收利用并实现内涵体逃逸等，进而最大程度地提高modRNA的利用率。新兴的生物材料和纳米技术的发展为modRNA的有效传递提供了一定的技术支持，有研究表明，与常规的阳离子脂质体相比，合理利用纳米颗粒或鱼精蛋白不仅能够实现modRNA靶向运输，还能够提高细胞摄取率及蛋白表达量，降低细胞的毒副作用[32]，可能是良好的modRNA运载体。

此外，如何控制modRNA的体内降解时间、翻译效率等从而精确控制目标蛋白的浓度、维持时间等，是modRNA应用于疾病治疗时需要面对的另一个问题。未来需要从modRNA结构的改进、新的修饰方法的筛选等多方面进行研究，从而更好地控制目标蛋白的表达。

综上所述，modRNA作为一种新型的基因表达载体，它能够实现目的基因瞬时、高效、局部表达，既避免了DNA载体所涉及的基因整合及病毒安全性等问题，也在很大程度上解决蛋白载体半衰期短及强免疫原性引起的过敏反应等问题[12，20]，随着对modRNA化学结构的深入认识及修饰方式的不断改进，将进一步促进该技术在不同领域研究中的应用。因此，modRNA技术有望实现真正意义上的技术革新和临床转化应用。