干细胞移植后示踪技术的研究进展

刘志燕 龙瀛 何晓晓 周晓

【提要】 干细胞具有再生和分化的能力，干细胞移植已经越来越多地应用于疾病的治疗。在干细胞移植的实验研究中，需要对干细胞进行标记，来观察和追踪其在宿主内的分布和增殖等情况。目前，干细胞标记主要分为直接标记和间接标记。直接标记即将标记试剂直接引入到干细胞中，间接标记是将报告基因整合到细胞中，继而检测基因表达产物。本文对现有的干细胞示踪技术的优缺点和研究进展进行综述。

干细胞是指能够自我更新并分化为不同类型细胞的未分化细胞，依据其来源可分为两种类型：胚胎干细胞和成体干细胞。由于干细胞具有分化为特定细胞的能力，已经越来越多地应用于各类疾病的治疗，如肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病、视网膜疾病和新生儿颅脑损伤等，取得了重大进展[1-5]。干细胞在移植后可以迁移到损伤和病变的部位，然后分化为靶细胞并定植于损伤部位，发挥治疗作用[6]。

在干细胞研究中，需要通过标记干细胞，以观察和追踪其在宿主体内的迁移、分布、增殖和分化等情况。目前，有两种细胞示踪技术应用于干细胞疗法，一种是用分子探针直接标记细胞，另一种是用报告基因间接标记细胞[7-8]。为了更好地了解干细胞在体内的生物学行为，选择合适的示踪技术至关重要。本文比较各种示踪技术的优缺点，并对目前干细胞示踪技术的研究进展进行综述。

1 直接标记

在干细胞标记中使用最多的就是直接标记，即将标记试剂引入到移植的细胞中。直接标记不会对细胞进行遗传修饰，具有安全可靠的优点。但是，随着细胞的分裂，每个细胞中的标记物会逐渐减少或消失，从而影响干细胞的示踪。

1.1 磁共振对比剂标记

此方法是移植前用MR对比剂标记移植细胞，然后利用磁共振成像（MRI）对细胞进行追踪。MRI具有较高的时间和空间分辨率，且无放射性损害，使其逐渐成为活体细胞示踪的研究热点[9-10]。磁共振示踪剂的种类较多，包括氧化铁颗粒、顺磁性物质和19F等。

氧化铁颗粒依据颗粒大小又分为：超顺磁氧化铁颗粒（SPIO，直径 50～200 nm），超小超顺磁氧化铁（USPIO，直径 35 nm）和微米顺磁氧化铁纳米粒子 （MPIO，直径约1 μm）[11]。MPIO含铁量最高，最敏感，但因其不能被生物降解、长期存留在体内而限制了其在研究和临床中的应用[12]。SPIO标记细胞后与血红蛋白结合或参与其他代谢过程，能被生物降解，是目前为止唯一被用于临床的对比剂[13]。由于细胞膜表面和未修饰的SPIO均带负电荷，使SPIO颗粒难以被细胞摄入，需要在SPIO表面修饰转染试剂来提高标记效率。Horak等[14]发现，与没有修饰的SPIO相比，兔BMSC对表面修饰D-甘露糖的SPIO颗粒摄取量明显提高，且细胞功能、活性和增殖能力均未受影响。此外，用多聚赖氨酸表面修饰的SPIO标记人间充质干细胞，发现修饰后的SPIO摄取率达92%，并在大脑病变区通过MRI示踪到了移植的干细胞[15]。Karussis等[16]用SPIO标记间充质干细胞后移植到多发性硬化症和脊髓侧索硬化症患者体内，用MRI观察到细胞的分布和分化，且未发现SPIO导致的细胞病理改变，说明SPIO在临床上是安全可行的。但是，SPIO作为示踪剂也存在不足：①灵敏度较低；②SPIO浓度随着细胞分裂而逐渐稀释；③标记细胞死亡后释放的SPIO被其他细胞吞噬，造成假阳性[17]；④SPIO的标记效率与用量有关，但高剂量的SPIO会导致细胞活力降低[18]。

用于MRI对比剂的顺磁性物质主要有钆 （Gd3+）和锰（Mn2+）两类，但是Gd3+和Mn2+都有细胞毒性，限制了其在生物体内的应用。Gd2O3@MCM-41是一种钆的新型对比剂，与Gd3+相比，对细胞无毒性，且对细胞分化影响小。Shen等[19]用Gd2O3@MCM-41标记的神经干细胞移植小鼠体内后，用MRI追踪了14 d。

19F作为对比剂敏感度高，且信号强度与19F的量成正比，故可用于量化标记的细胞[20]。Helfer等[21]的研究表明，用19F标记鼠BMSC会造成细胞活力的一过性降低，但很快恢复正常，并观察到BMSC在脾脏内发育成正常的集落形成单位，说明标记了19F的BMSC仍具有分化治疗作用。但是19F对细胞毒性的影响不明，还需要进一步的研究。

1.2 荧光标记

1.2.1 荧光染料的非特异性标记

不同的荧光染料可以与干细胞的细胞膜或细胞核等不同部位可逆或不可逆地结合，然后通过荧光显微镜可以观察干细胞的迁徙和存活等情况。目前已有多种荧光染料被用于标记干细胞。

Dil是一种亲脂性碳花青染料，因为能够嵌入细胞膜的脂质双分子层内做侧向扩散运动，所以可以标记整个细胞膜。Dil对活体细胞没有毒性，不会从标记的细胞转移到未被标记的细胞，且荧光衰减率低，可用于观察细胞迁移和分化情况[22]。韩明子等[23]成功将Dil标记小鼠骨髓细胞，并在肝脏中检测到荧光，证明其来源于骨髓细胞。虽然Dil的细胞毒性低，但是会影响早期的细胞增殖，传代后细胞内的荧光会衰减，也不利于干细胞的长期示踪，只能用于细胞短期示踪[24]。

Hoechst是一种双苯酰亚胺类核荧光染料，细胞通透性高，可与细胞核内双链DNA的碱基牢固结合，在紫外线激发下，能发出明亮的蓝色荧光。Hoechst的标记率高，保存时间长，细胞毒性低。Lee等[25]将Hoechst标记的骨髓干细胞移植到小鼠体内4周后，仍能观察到标记细胞。

在最近报道的荧光材料中，聚集诱导的发光荧光素（AIEgens）引起了生物学领域越来越多的研究兴趣[26-28]。与常规有机染料不同，AIEgens是具有旋转单元的螺旋桨形分子，由于分子运动的限制，只有在聚集形态时才能强烈发射[29-30]。AIEgen构建的生物探针，具有低背景干扰、高灵敏度和优异的耐光漂白性等优点。Yang等[31]将AIE粒子标记脂肪干细胞后植入小鼠放射性皮肤损伤部位，发现其能稳定追踪ADSC，并且不影响ADSC的治疗作用。

1.2.2 荧光染料的特异性标记

荧光染料的特异性标记即Y染色体标记。雄性物种与雌性物种相比，含有特殊的Y染色体。通过对Y染色体的长臂末端含有的一段重复序列进行荧光原位杂交，可对细胞进行示踪，具有技术简单、标记效率高等优点，并且时间、组织类型和细胞表型的变化对标记没有影响[32]。Crain等[33]报道了将男性亲属的BMSC移植给女性患者后，对患者脑组织进行切片，检测到了含有Y染色体的神经细胞，说明BMSC能够分化为神经细胞。Dalakas等[34]将男性BMSC移植到女性酒精性肝病患者体内，用FISH成功检测到Y染色体，证实了BMSC有向肝肌成纤维细胞分化的能力。然而，Y染色体标记的缺点是不能用于自体移植和女性供体时的示踪。

1.2.3 荧光纳米材料标记

量子点（QDs）是由硒化镉制成的半导体荧光纳米材料，具有宽的激发波长、窄的发光谱和强的发光性能等，已经越来越多地应用于活细胞的标记[35]。但是，量子点因为其结构特点而难以通过被动扩散的方式快速穿过细胞膜，故需通过吞噬、肽介导的转运和受体介导的内化等方式进入细胞内[36-38]。Shah等[39]将多肽RGD偶联的QDs与间充质干细胞一起培养后，发现间充质干细胞吞噬QDs后仍保持增殖和分化的特性。Lei等[40]将多肽Tat连接在聚乙二醇包被的QDs后标记间充质干细胞，然后将标记了的干细胞注射到小鼠尾部，最后在肝、脾和肺部都观察到了荧光。Rosen等[41]用DQs标记的干细胞在心脏中维持了至少8周。这些研究表明，QDs可以作为探针标记自我更新和分化的干细胞，并且QDs在一定浓度范围内对细胞形态和增殖没有影响，也不影响细胞的正常生理代谢，可用于细胞的长期示踪[42]。然而，由于大多数量子点有镉离子，在高浓度时对标记细胞有生理毒性，影响标记细胞的增殖[43]。

2 间接标记

间接标记又可分为报告基因标记和核酸标记，即将DNA序列或核酸类似物整合到细胞基因组中，继而编码能够产生对比的蛋白质或通过抗原抗体反应追踪干细胞。使用这种标记技术，信号不会随着细胞分裂而丢失，因为报告基因能与基因组基因一起复制，并且强度与细胞数量相关，所以也有利于细胞计数[44]。

2.1 报告基因标记

Liang等[45]将PRE9基因作为报告基因标记神经干细胞后移植到免疫缺陷小鼠脑内，并进行体内和体外发光鉴定，发现PRE9在620 nm处稳定发光，并且发射峰不受pH值影响，受组织吸光度的影响也很小。

1962年，Shimomura等[46]在水母体内分离出了一种由238个氨基酸组成的单体蛋白质，因为能在荧光显微镜下吸收400 mm的蓝光并发出508 mm的绿色荧光，所以命名为绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）。 随后，不同波长的荧光蛋白相继被发现，包括黄色荧光蛋白（Yellow fluorescent protein，YFP）、蓝色荧光蛋白（Blue fluorescent protein，BFP）和红色荧光蛋白（Red fluorescent protein，RFP）等。 荧光蛋白基因通过病毒和质粒等载体与目的蛋白基因整合后，可以在宿主细胞内表达并在激发光照射下发出荧光。GFP对细胞的毒性作用和不良反应较小，细胞活力和完整性几乎不受影响[47]。但野生型的GFP在发光强度和灵敏度方面较差[48]，目前使用较多的是人工突变体增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP），EGFP 增强了 GFP 的荧光性能，改善了GFP的热稳定性，有较好的发光强度和灵敏度。Pinero等[49]用EGFP标记了BMSC，研究其对坐骨神经髓鞘再生的作用，观察到了至少持续60 d的荧光稳定表达。

但是，由于宿主基因对外源报告基因的沉默，报告基因可能在传代后表达减少，这种情况在逆转录病毒转染干细胞时尤为常见[50]。整合载体对细胞进行遗传修饰还存在许多潜在的安全问题，更重要的是有可能激活附近的原癌基因，将想要标记的治疗细胞转化为恶性细胞[51-52]。因此，间接成像技术通常仅在终末期患者中使用[53]。

2.2 核酸标记

溴脱氧尿嘧啶（BrdU）是一种嘧啶类似物，是最具代表性的核酸标记物。BrdU在DNA复制时，可以与胸腺嘧啶竞争，加入到DNA的核酸序列中。BrdU被用来标记增殖期细胞，通过定量评估细胞合成DNA的水平，可以量化标记细胞。马晓菁等[54]用BrdU成功标记了骨髓干细胞，在大鼠创面观察到了阳性细胞的聚集。BrdU标记简单易行，对细胞无毒性，但是BrdU需要DNA变性后才能与抗体结合，常导致染色弥散，移植了BrdU的细胞死亡后也会将其释放出来污染邻近细胞，出现假阳性[55]。5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）是另外一种胸腺嘧啶核苷类似物，无需DNA变性即可检测，但EdU能降低干细胞的活力，损害细胞表型，应该避免EdU标记用于干细胞示踪[56]。

卢荣等[57]用 Hoechst 33342、BrdU、GFP三种方法标记皮肤干细胞，结果显示三种物质对细胞没有明显毒性作用。其中，Hoechst 33342的标记率最高，但随着时间的延长荧光逐渐衰减；GFP标记最稳定，但标记率低；BrdU标记细胞较稳定，标记率也较高。

综上所述，目前干细胞示踪方法众多，每种方法都有各自的优缺点，我们需要根据不同的细胞情况或实验类型选择最适宜的标记方法，以达到最好的示踪效果。理想的示踪方法应该具有简单易行、特异性强、灵敏度高、细胞毒性低、受外界干扰小以及移植干细胞的长期定量等优点。随着干细胞研究的不断深入，干细胞示踪技术也将得到不断发展。