听神经病及亚型听突触病：声音编码与突触研究进展

王秋菊 Tobias Moser

1解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科 解放军耳鼻咽喉研究所（北京100853）

2 Institute for Auditory Neuroscience，University Medical Center Göttingen，Robert-Koch-Str.4037075 Göttingen，Germany（Tobias Moser）

听神经病/听神经病谱系障碍(auditory neuropa⁃thy,AN/auditory neuropathy spectrum disorder,ANSD)，是一种特殊的听觉功能障碍性疾病[1]，它描述了一种内毛细胞（inner hair cells,IHCs）、带状突触、螺旋神经节神经元（spiral ganglion neurons,SGNs）和/或听神经本身功能不良所致的听觉障碍[2]。临床主要表现为患者可以听到声音却不能理解其语义，患者的听觉时域处理功能下降，言语识别率与纯音听阈不成比例的下降；外毛细胞的功能正常--耳声发射（otoacoustic emissions,OAE）和/或耳蜗微音器电位（cochlear microphonic,CM）可引出，而听神经功能异常--听性脑干反应（auditory brain⁃stem response,ABR）异常或全部消失，同时多可伴有中枢或周围神经病变[3]。随着听神经病在遗传学、生理学、分子细胞学以及动物模型方面的研究进展，围绕听神经病产生的各种临床亚型也在不断的被发现和描述，其中最值得一提的是听突触病（auditory synaptopathy）。

听突触病是近年来逐渐明确并定义的听神经病中的一个亚型，由可以影响突触囊泡内谷氨酸在突触前膜的释放，Ca2+内流，或突触囊泡的胞吐作用的遗传学改变所引起的内毛细胞带状突触功能的损坏而产生的疾病表型，谓之“听突触病”[1]。目前“听突触病”一词主要应用于描述听神经病患者中明确病变位于突触，且由致病基因变异导致疾病发生的这种类型，尚未应用于诸如隐性听力损失，虽然其病变也位于突触，但不是由于基因变异所致的疾病诊断。

听神经病是一种复杂的累及听觉环路功能的听觉障碍性疾病，从其发现、诊断、病因机制的揭示，到分型定位诊断经历了一个将基础研究的最新进展转化应用于临床疾病的精准鉴别诊断和个性化干预的发展历程，是转化医学和精准医学的典范之一。20年来，在听神经病的诊断和认识过程中，我们持续努力的目标是：（1）精准而早期的诊断听神经病；（2）明确定位病变的部位、发生的病因和机制；（3）明确疾病进展的速度和趋势；（4）明确何时进行助听干预，何时进行人工耳蜗干预；（5）明确致病基因，并阻断其在家族中的传递，提升患者的沟通交流和理解能力。

要实现上述目标，需要了解内毛细胞、突触、螺旋神经节、听神经、耳蜗核等，及各级听觉中枢组成听觉环路的功能和工作原理，需要进行围绕内毛细胞、突触、听神经为中心轴的听觉信息传输与处理的生理病理学机制研究，需要长期随访听神经病患者的发生发展趋势，需要探索未来基因治疗的可能及可行性，将诊断和治疗推进到精准的分子基因水平。因此，本文探讨和综述了目前与听神经病及亚型听突触病相关密切的毛细胞声音编码和突触功能研究进展的部分内容，便于更好的理解听神经病及亚型听突触病。

1 毛细胞、突触、螺旋神经节与声音编码与传递

自20世纪70年代以来，感音神经性耳聋的发病机制主要集中在毛细胞的功能障碍或数目减少以及耳蜗内离子稳态的失衡理论，而较少强调突触在听神经的神经传导和声音编码中的作用。1992年顾瑞[4]等报道了16例不能用耳蜗病变解释的以低频减退为主的感音神经性聋的病例，其言语识别率与纯音听阈明显不成比例，ABR无法引出或显著异常，诊断为低频中枢感音神经性聋。1996年Arnold Starr和他的同事报道了外毛细胞功能正常的感音神经性听力障碍患者，此类患者的CM和OAE正常，但ABR和复合动作电位表现异常，提示听神经功能受损[5]。同时也发现患者的言语识别率与纯音听力图所显示的听力损失相比呈现不成比例的明显下降。尽管患者的频率识别能力正常，但他们对声信号的时域信息处理能力是异常的，这种时域信息编码功能的异常会导致患者的声音定位、言语感知和音乐鉴赏能力降低。因此，时域信息神经编码功能的减退是听神经病及亚型听突触病患者听力损失的主要原因。

1.1 毛细胞的特性

外毛细胞具有对声音的调谐与放大特性，内毛细胞具有将声信号传入和编码的特性。外毛细胞作为声音机械刺激的效应器来发挥作用，内毛细胞将内耳感受到的声信号转换成神经冲动，内外毛细胞协同作用，缺一不可。听神经病患者多表现为外毛细胞功能正常，而内毛细胞功能不良所导致的听力障碍，所以以下主要阐释内毛细胞的特性。

在哺乳动物耳蜗中,内毛细胞是耳蜗内一种负责将声音引发的机械信号转化为神经编码的感觉细胞。由于毛细胞束的偏转，位于静纤毛顶端的机械传感通道开放，引发毛细胞的去极化。IHCs带状突触对声音的编码非常精密高效，每个突触后螺旋神经节神经元只接受来自一个内毛细胞的谷氨酸突触前活性区的信号输入[6]，IHCs和SGNs之间的谷氨酸能突触可在亚毫秒级的时间精度内以几百赫兹的速度实现持续的信号输入。突触传递的时间精度非常高，螺旋神经节神经元的脉冲时间也可锁定到频率高达约1kHz的声音刺激[7,8]。突触前递质的释放，甚至只有一个囊泡释放，也足以触发一个动作电位[9]。因此，内毛细胞的特性是通过内毛细胞的突触特性来体现其将机械信号转化为化学递质释放，实现声音信息编码的功能。当病变累及内毛细胞时，其传入神经突触或螺旋神经节神经元对声音的传递功能降低，由于复合动作电位和听觉脑干反应是由大量SGNs同步活动的总和产生的，因此，当动作电位的延迟变异和神经元活性丧失同时存在时，则会导致SGNs的总体响应非常小，无法产生同步化的动作电位波形，这也是听神经病及亚型听突触病的复合动作电位和听觉脑干反应无法引出的重要原因。

1.2 内毛细胞带状突触特性

内耳通过专能化的突触，从毛细胞向螺旋神经节神经元以亚毫秒的精度，高速率、持续地传递声音信息。最新的观点是，毛细胞突触是通过非传统的突触前分子结构来实现其严密的声音信息传递功能的。带状突触包含了突触前、突触间隙和突触后三个组成部分，带状突触的突触前即为内毛细胞底部区域，其核心是呈纺锤形的电子致密体和外围大量锚定的突触囊泡，两者共同组成了活性区域（activi⁃ty zone,AZ），内毛细胞的带状突触组成突触前膜[10]；而突触后结构则由听神经末梢形成，其上密布各种受体结构，形成具有突触后电子致密体的突触后膜[11]。每个内毛细胞与大约10-30个螺旋神经节神经纤维形成传入神经突触，通常认为每个螺旋神经节神经纤维只接受来自一个内毛细胞活性区的信号输入。毛细胞活跃区内包含突触致密体，突触致密体带的主要结构成分是RIBEYE[12]，一种由易聚集的A结构域和具有酶活性B结构域组合而成的蛋白质，这两个结构域都是由CtBP2基因转录而成[13]。突触致密体有助于IHCs活性区内大量Ca2+通道补体的聚集和囊泡的快速释放，从而实现同步化听觉信号传导，同时促进囊泡的持续补充[14-16]。另一个重要的突触前分子结构是由1个耳聋基因编码的多C2结构域的Otoferlin蛋白，其在囊泡通过胞吐作用排出细胞的过程中发挥多方面的作用，Otoferlin可能是非传统突触蛋白家族中第一个被确定的参与调节内毛细胞突触胞吐作用的主要成员。此外，不同于传统的谷氨酸能突触，内毛细胞突触对含有谷氨酸的囊泡的摄取由VGluT3[17,18]介导，而不是VGluT1或VGluT2；Ca2+作用的是Cav1.3L-型 Ca2+通道，而不是 Cav2.1P/Q-型或Cav2.2N-型Ca2+通道[19,20]。编码 Otoferlin 蛋白、VGluT3和Ca2+通道复合体的基因发生缺陷，都会导致听突触病，是目前研究进展中逐渐明晰的一个听神经病亚型疾病。

1.3 螺旋神经节特性

螺旋神经节使双极神经元实现高频率时间精度的声音编码与传递。SGNs是一种双极神经元，在耳蜗内被雪旺氏细胞包裹，在进入脑干处被少突胶质细胞包裹。每个SGNs都被调谐到一个可以最大程度触发神经活动的特征频率。这一特征频率与由螺旋神经节神经元支配的柯蒂氏器内毛细胞的音质定位相对应。研究发现，特征频率几乎相同的SGNs支配同一内毛细胞的可能性很大，但它们的自发和声诱发放电率却有很大的不同。这种神经多样性的起源并不是很清楚，但很可能与毛细胞带状突触的突触前和突触后功能不同有关。SGNs进行位相型放电，即它们会发出一个或几个波峰，即使是对持续性注入电流的反应也一样[9,21]，此特点很可能是由于超极化K+电导所导致[21]。SGNs是电“密集型”细胞，显示出较强的兴奋性突触后电流[22]；突触前递质的释放，甚至只释放了一个囊泡[23]，也足以触发一个动作电位[9]。螺旋神经节神经元动作电位产生的位置最有可能位于在离内毛细胞突触只有几微米的外周螺旋神经节神经元神经树突的Heminode处[9]。

与听神经下游完整的朗飞氏结类似，有髓纤维之前的半节神经纤维具有大量的电压门控Na+（NaV）通道[24,25]，以及远端轴突的被动电特性，这使得传入的兴奋性突触后电位很容易触发螺旋神经节神经元峰电位[9]。这种机制的基础是声音编码的高时间精度，声音编码需要检测声刺激的时域信息。内毛细胞神经递质释放异常，螺旋神经节神经元内峰电位的产生或传导障碍，以及从SGNs到耳蜗核神经元之间突触传递发生变化，都会使听觉信息到大脑的信号传输异常。由此导致的时间精度（或同步化）减退和听觉信号不准确的神经表达（由突触和/或神经元丢失引起）被认为是听神经病及亚型听突触病的主要发病机制[14,16,24,26-28]。

1.4 声音编码与传递

当声能将充满液体的耳蜗的压力波启动后，听觉开始产生。这种液体运动导致基于肌动蛋白的静纤毛束偏转，静纤毛束偏转打开了毛细胞膜上的机械门控离子通道，导致带状突触上的谷氨酸释放，释放的谷氨酸使螺旋神经节神经元上的受体活化，且由轴突延伸到听觉脑干。如上所述，带状突触是内毛细胞突触特有的结构，动物研究极大地促进了我们对听觉障碍发病机制的深入了解，尤其是那些会影响毛细胞带状突触声音编码的机制。IHCs带状突触对声音的编码非常精密高效，在不同的细胞类型、发育时期以及动物种类中，带状突触的形状和大小不同[29-31]，带状突触有助于IHCs活性区内大量Ca2+通道补体的聚集和囊泡的快速释放，从而实现同步化听觉信号传导，同时促进囊泡的持续补充[15,16]。Ca2+摄取与囊泡融合的偶联方式决定了突触传递的特性。有两种不同的观点[32-34]：(1)“Pure”Ca2+纳米结构域控制的Ca2+促进囊泡的融合是由单个电压门控Ca2+通道作用和(2)“Pure”Ca2+微米结构域控制的Ca2+感受器上的Ca2+的数量主要受Ca2+通道数量的影响，单个通道的影响可以忽略不计。除了囊泡Ca2+感受器相关通道的精密结构、数量以及开放概率，囊泡Ca2+感受器的Ca2+结合特性和活性区细胞溶质性Ca2+的缓冲也会影响偶联过程[8]。此前的研究通过结合听觉产生后的小鼠内毛细胞内全细胞Ca2+的释放和膜电容测量，检测了囊泡Ca2+感受器的Ca2+结合特性。这些实验证明在囊泡融合前需要4到5个Ca2+相互结合，并认为该感受器具有低Ca2+亲和力。然而，需要注意的是这种方法会导致大规模的胞吐现象(增多的细胞膜相当于细胞表面的15%)。因此,这个过程不太可能完全由IHCs活性区的胞吐作用介导，也可能涉及突触外的胞吐发生。这就要求通过使用精细化的方法重新研究突触囊泡融合的内在Ca2+依赖性,最好是利用更加成熟的IHCs。经典的[35]以及更多最新[36-38]的研究表明，平均每个毛细胞活性区拥有几十个Ca2+通道。然而,对于一个特定的IHCs，无论其频率位置如何，每个AZ的Ca2+通道数量差异很大。这种突触前异质性被认为与宽动态范围的声音编码的需求有关[36,39-41]。声音的精准编码与传递，不但依赖于突触前递质释放机制的阐释，其兴奋性突触后电流的单量子与多量子释放理论的认识目前还在争议中。

2 与遗传学相关的致病机制与突触功能研究进展

随着听神经病患者的临床遗传学研究和听觉生理学的分析以及动物模型的机制研究进展，听神经病的分型越来越精细，目前听神经病可分为遗传性听突触病、遗传性听神经病和后天获得性听神经病、获得性听突触病，对最新进展的了解和掌握将帮助我们在临床疾病的分型分类和干预时有所依据。在此，主要针对与遗传性听突触病密切相关的OTOF基因（Otoferlin）、SLC17A8（VGluT3）基因以及OPA1、AIFM1、MPZ、PMP22、PJVK及DIAPH3基因相关的遗传性听神经病的最新发病机制和临床意义进行简要总结，以明确听突触病与听神经病不同的相关基因及功能[3]。

2.1 遗传性听突触病

由OTOF基因导致遗传性听突触病，OTOF的无义或截短突变导致IHCs中Ca2+触发的胞吐作用几乎停止，错义突变会降低毛细胞中的Otoferlin蛋白水平，且囊泡补充的缺陷几乎完全损害了内毛细胞突触的声音编码功能。只有用最高声压级的声音以低刺激频率刺激时才能触发SGNs的单个神经元出现波峰，但螺旋神经节的总体响应仍然检测不到（可通过ABR和耳蜗电图评估，ABR和耳蜗电图是可以帮助确定病变部位的有效诊断工具）。携带OTOF基因错义突变的患者的心理物理学和生理学测试提示传入信号渐进性减弱，产生听觉疲劳现象[42-48]。OTOF基因在成人及婴幼儿中的突变频率及临床表型特征以及温度敏感性患者的突变特征研究发现OTOF基因致病变异是婴幼儿听神经病的主要病因之一[45,49-51]。

由SLC17A8基因变异也可导致遗传性听突触病，缺乏VGluT3的IHCs表现为Ca2+内流和突触囊泡循环正常以及突触前膜形态正常[18]或仅轻微改变[17]，但毛细胞带状突触中囊泡摄取功能障碍，使囊泡含有的谷氨酸水平降低，进而释放到突触间隙的谷氨酸水平下降，不足以在一级神经元中产生动作电位，没有兴奋性传入突触信号传递到SGNs，听觉通路的声诱发活动也检测不到[17,18]，最终导致毛细胞突触信号传递缺陷[52]。在患者听力损失的致病机制方面，听力障碍的发生机制中有两个观点：一个观点是单倍体剂量不足可能会导致出现一个无功能的SLC17A8等位基因；另一个观点是功能增强型突变会导致信号传导增强，这会使内毛细胞突触由于囊泡谷氨酸负荷增加而出现兴奋毒性突触损失。另外，携带SLC17A8基因突变的个体中观察到听力障碍伴有精神和运动发育迟缓[53]，认为与SLC17A8基因突变有关的听力障碍也可能是综合征型的一种表型。

2.2 遗传性听神经病

由OPA1基因变异导致遗传性听神经病，OPA1蛋白C末端的截短突变主要是由于单倍剂量不足导致非综合征型常染色体显性视神经萎缩（DOA）[54,55]；错义突变可能通过突变蛋白的显性负效应而导致综合征型常染色体显性视神经萎缩（DOA+）[56]。DOA+相关的听力障碍主要是由OPA1基因Arg445His错义突变导致的，该突变可引起视神经和听神经脱髓鞘及突触丢失[56,57]。

由AIFM1基因变异导致遗传性听神经病，为本土克隆的致病基因，其结构包括两个黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）结构域、一个烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）-结合区和一个具有凋亡前活性的C-末端结构域。在N-末端还有一个线粒体定位序列（MLS）。在第一个FAD结构域和MLS之间，存在一个潜在的跨膜结构域（TM）。此外，AIF还含有两个DNA-结合位点，以及热休克蛋白Hsp70、亲环素Cy⁃pA的结合区。AIF蛋白功能主要是诱导细胞凋亡，参与调控线粒体的结构和氧化代谢过程，影响呼吸功能。数据库收录变异位点230个，其中致病位点151个。AIF是作为caspase-非依赖性凋亡效应分子被发现的，在凋亡损伤时由线粒体转运至细胞核，诱导细胞凋亡[3]。在听觉通路中，无论是内毛细胞，神经通路中的胶质细胞，还是螺旋神经节细胞等，正常的能量代谢，是其维持其生理活性的关键[58]。

由MPZ基因导致遗传性听神经病的发病机制是MPZ的杂合突变可以通过功能丧失减少正常蛋白的总体数量，或通过显性负性作用破坏MPZ复合体的形成或正常功能。纯合型突变通过功能丧失机制导致MPZ的完全缺失，从而产生周围神经的脱髓鞘病变[59]。听觉神经纤维突触丢失与脱髓鞘通过减少传入及减缓动作电位的传导而导致听觉信号时间编码紊乱[60]。

由PMP22基因导致遗传性听神经病是由于PMP22点突变导致严重的髓鞘发育不全或脱髓鞘[61]。变异的PMP22蛋白常常会在内质网或高尔基复合体中形成蛋白质聚积体。这些变异蛋白质聚积体还可能阻断正常PMP22蛋白向细胞膜的运输[62]。

由PJVK基因导致遗传性听神经病的病理机制是PJVK基因编码的蛋白pejvakin主要表达于耳蜗Corti器、螺旋神经节细胞以及前三级听觉传入通路（耳蜗核、上橄榄复合体、下丘）的神经元细胞中，所致听神经病的病变部位主要位于听觉传导通路，影响动作电位的传导及细胞内物质交换，而内毛细胞功能不受影响，导致的听神经病以突触后型为主[3,63,64]。

由DIAPH3基因导致遗传性听神经病的可能机制是既可导致突触前病变也可引起突触后病变。Diaphanous蛋白既存在于果蝇的神经肌肉接头处的突触前成分，也存在于其突触后成分[3]。DI⁃APH3基因可调控突触前肌动蛋白[65]，维持细胞及静纤毛形状、囊泡转运[60,66]，调控微管细胞骨架的活动[65]，故DIAPH3基因突变时可导致突触前病变。DIAPH3基因也可上调基因表达，使听神经纤维末梢树突形态发生改变，影响螺旋神经节细胞树突棘的功能，产生迟发性的毛细胞功能损伤[3]，导致突触后病变。

3 听神经病及亚型听突触病基因治疗的未来前景

基因治疗是未来对特定类型听神经病的可行的治疗方式。Omar Akil等对缺少囊泡谷氨酸转运蛋白-3（VGLUT3），内毛细胞传入突触的谷氨酸释放能力丧失而出现耳聋的小鼠，使用1型腺相关病毒（AAV1）将VGLUT3传递入耳蜗，尽管病毒摄取比较广泛，但其仅在内毛细胞中进行基因表达，在AAV1-VGLUT3递送的2周内，ABR阈值正常化，以及部分惊跳反射的恢复。最后，该小鼠在传入的内毛细胞带状突触中观察到的形态学变化的部分逆转，从而通过基因治疗使小鼠成功恢复听觉，这是耳聋基因治疗方面的重大进展[67]。目前在很多动物中已经实现了将携带目的基因的病毒载体递送到耳蜗内这一过程，并且已用于临床试验中，旨在将支持细胞转分化成毛细胞[68]。Wan等研究表明，编码耳蜗类神经胶质支持细胞中神经营养因子3（Ntf3）基因的过表达促进噪音引起损伤后突触数目和功能的恢复[69]。Ntf3是神经生长因子家族的一种神经营养因子，它能维持已建立的神经元并刺激新神经元的生长。Lisa L.Cunningham等也进一步验证了噪音引起的突触病变是可恢复的，甚至提高了其在暴露于破坏性噪音后进行治疗的可能性[70]。虽然这些研究结果很乐观，但是还需要更多的时间才能将这些治疗方法应用听神经病及亚型听突触病患者。而我们在临床上发现的OTOF基因突变患者（先天性）以及AIFM1基因突变患者（迟发型），后者拥有更好的时间窗来进行未来基因治疗的研究与尝试，具有可期待的治疗前景。

关于听神经病及亚型听突触病的毛细胞声音编码与突触功能的研究一直是多年来难以攻克的难题。经历了20多年的从发现到渐入精准的过程，取得了20年前无法想象的进展，但仍然还有诸多机制有待挖掘和发现，对听神经病及亚型听突触病的毛细胞声音编码与突触功能的研究以及未来的基因治疗研究仍然是今后的主要方向；推广基于精准医学的分子分型定位诊断以及个性化康复干预是目前有效的方法与途径。