外泌体在重症急性胰腺炎发病机制中的作用

姜春晖 曾彦博 杜奕奇

海军军医大学附属长海医院消化内科，上海 200433

【提要】 外泌体作为细胞间通讯的新途径，可以负载蛋白质、脂质、核酸等发挥生物活性作用，在众多疾病的演进和转归中起到举足轻重的地位。重症急性胰腺炎早期外泌体可由胰腺腺泡释放，引起全身炎症反应，并调控远隔脏器损伤，如急性呼吸窘迫综合征或肾损伤。本文就外泌体在重症急性胰腺炎引起的相关疾病如急性肺损伤、肠道功能紊乱、急性肝损伤、急性肾损伤等发病机制中的作用，以及针对外泌体这一靶点是否可研发治疗重症急性胰腺炎相关疾病的药物作一展望。

外泌体(exosomes)是细胞间的重要通讯媒介，直径30～100 nm，具有脂质双层膜的囊状结构，内含蛋白质、脂质体和核酸[1-2]，由Clifford Harding团队在研究网织红细胞成熟过程中首次发现[3]。外泌体在生理病理状态下可由多种细胞分泌，存在于大多数体液中[4]。不同细胞来源的外泌体所含有的生物分子具有细胞种属特异性，可通过研究外泌体来追溯其细胞来源。由于外泌体不易被蛋白酶和核糖核酸酶所降解，可以在不同的组织细胞中传递蛋白质、脂质体和核酸等生物分子，因此在细胞间通讯[5]、免疫调节[6]、疾病演进[7]等过程中发挥生物活性作用。本文就外泌体在重症急性胰腺炎(SAP)引起器官损伤的发病机制中的作用作一综述。

一、外泌体在SAP发病机制中的作用

生理情况下，乙酰胆碱或者胆囊收缩素通过PIP2-IP3-Ca2+和RYR通路激活内质网释放储存钙，由储存钙释放激活的钙内流，促进线粒体ATP的生成，同时激活腺泡细胞顶端分泌颗粒释放消化酶原。近年来研究证明，胞内钙超载、线粒体功能障碍是胰腺腺泡细胞和导管细胞功能障碍致SAP的关键步骤。 持续性胞质内钙超载导致线粒体膜受损，即线粒体通透性转换孔的通透性增加，膜上电位改变致ATP生成减少[8]，使细胞膜上的Ca2+-Na+泵及内质网上的Ca2+泵障碍，加重胞内钙超载，激活细胞内及周围的酶原，导致胰腺自我消化[9]。 线粒体功能障碍使细胞自噬能力受损，活性氧类物质、细胞因子等产生，加重胰腺细胞及组织的损伤。损伤的胰腺细胞产生组织因子、DNA、热休克蛋白等损伤相关分子模式诱导中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞浸润，激活NF-κβ、MAPK、STAT3等炎症信号通路，使局部的炎症扩展到全身炎症反应。线粒体损伤又加重内质网应激、溶酶体破坏、组织蛋白酶原及胰蛋白酶原等的释放和激活，导致胞质蛋白降解，使细胞坏死。研究表明，SAP时胰腺腺泡细胞是致病外泌体的主要来源，SAP腺泡细胞的培养基可见丰富的外泌体。这些外泌体的存在是激活巨噬细胞的重要条件，并通过对外泌体中的miRNA及靶基因的分析，证实SAP腺泡细胞主要通过MAPK途径来激活巨噬细胞[10]。SAP腺泡细胞中的缓激肽原在激肽释放酶的作用下转变为缓激肽，缓激肽诱导胰腺星状细胞内钙超载。胰腺星状细胞与腺泡细胞相互作用，进一步加重SAP的严重程度[11]。实验证明，外泌体可以将miRNA-23a打包，进而激活CaN/NFAT信号途径[12]，使多种化学因子和自噬相关基因转录激活，致胰蛋白酶原在胞内及组织间质中过度分泌和激活。同时外泌体把SAP腺泡细胞及星状细胞产生的损伤相关分子打包，通过模式识别受体，如Toll样受体、C型凝集素体、类核苷结合寡头结构受体等激活胰腺外细胞及组织下游的信号途径，使局部炎症反应扩大到全身。此外，外泌体在抗原提呈中也起到重要作用。外泌体可以表达主要组织相容性复合物(major histocompatibility complexes,MHCs)，如来源于树突状细胞的外泌体表面可以表达MHCⅡ、CD83及CD40，激活上皮细胞和T细胞的促炎反应，并且可以通过TNF-α激活细胞的固有免疫，产生大量的细胞因子，致细胞及器官损伤[13]。总之，SAP来源的外泌体可通过介导基因的调控、抗原提呈、损伤相关分子模式等方式，级联放大炎症反应和导致多器官功能损伤[14]。

二、外泌体在SAP引起的器官损伤中的作用

1．外泌体与急性肺损伤：SAP常并发多器官功能衰竭，在胰外器官中，尤以急性肺损伤最为常见。SAP时促炎介质和细胞因子包括IL-8、单核细胞化学趋化因子-1吸引中性粒细胞，与肺内巨噬细胞一起加重炎症反应，导致肺上皮细胞凋亡和坏死，呼吸屏障通透性增加，富含蛋白的水肿液渗出，使肺泡表面活性物质失活，降低肺顺应性和气体交换功能[15]。 Bonjoch等[16]首次证实外泌体可通过血循环穿透肺泡内皮屏障到达肺泡，并被肺泡巨噬细胞吞噬而被激活，参与肺组织炎症反应并致肺损伤。外泌体还能影响肺血管的通透性。血管内皮钙黏连蛋白特异性表达于血管内皮细胞，是维持血管内皮细胞黏着连接和血管通透性的重要结构[17]。SAP时外泌体通过对位点磷酸化等方式破坏钙黏连蛋白结构，使细胞间的黏着连接减少，导致肺内皮细胞通透性增高[18]。肺水肿时肺泡上皮细胞肺泡腔侧的阿米洛利敏感Na+通道(ENaC)在肺液清除中起重要作用。通过对ENaC变异小鼠差异的研究，证实ENaC发生内吞或膜上表达量降低将导致肺液清除回流受损，过多的肺水肿液在肺泡腔内集聚，影响气体交换，导致急性呼吸窘迫综合征[19]。肺损伤急性期外泌体可激活TGF-β信号途径，调节ENaCβ亚基的活性，导致肺泡内水肿液的重吸收障碍；慢性期则通过基因的修饰与表达破坏肺泡毛细血管屏障，改变内皮细胞的通透性，加重肺水肿的程度[20]。外泌体还可以介导基因的调控。研究发现血浆中特异性miR-216a、miR-21-3p高表达与急性胰腺炎的严重程度相关[21]。肺上皮细胞衍生的外泌体可通过miR-17/221诱导整合素β1来调节巨噬细胞的迁移，通过炎症细胞的级联放大加重肺的损伤[22]。因此，外泌体是否通过一系列途径(如miRNA、蛋白等)调控肺血管内皮细胞的信号转导值得进一步研究。

2．外泌体与肠道功能紊乱：SAP引起肠道功能紊乱的机制繁多，包括氧化应激、SIRS、肠道上皮细胞通透性增加及肠道细菌易位等。SAP能刺激损伤的肠道上皮细胞分泌外泌体，一方面干扰素(IFN-γ)或内毒素诱导肠上皮细胞产生的外泌体能通过表达MHCⅡ分子表型，增强在炎症状态下外泌体介导的抗原提呈反应；另一方面，受损的肠上皮细胞外泌体可分泌膜联蛋白A1，该蛋白可促进肠道黏膜的修复，提示包含膜联蛋白A1外泌体的浓度高低可成为肠道黏膜炎症程度的生物学指标[23]。肠道上皮细胞旁连接蛋白是维持肠道功能屏障、抵御细菌侵袭的重要分子。SAP能降低细胞旁连接蛋白如ZO-1、occludin及claudin-1等的表达，使肠道壁通透性增加，促进肠道细菌易位[24]。外泌体通过传递不同的miRNA来调节肠道细胞间的连接及影响肠道细胞的通透性，如miR-21调节PTEN/PI3K/Akt轴来增加肠道上皮细胞通透性[25]，miR-29a能降低封闭蛋白1及NKκB抑制因子的表达使肠道屏障受损[26]。

3．外泌体与急性肝损伤：SAP并发肝损伤的发生率达88.9%，可通过细胞因子、炎症递质、氧自由基、肠道细菌易位及其释放的内毒素等损伤肝功能。肝细胞、胆管上皮细胞、肝星状细胞、肝窦内皮细胞等都可以成为外泌体的来源细胞或者靶细胞。肝细胞来源的外泌体能激活肝星状细胞与肝窦内皮细胞内的hedgehog信号通路，进而改变肝内皮细胞的基因表达，导致血管重塑，加重肝损伤[27]。急性肝损伤可以导致肝窦内皮毛细血管化，损伤屏障功能。在坏死性胰腺炎早期就可以通过炎症因子、腹水相关因子等方式损伤肝细胞。应激状态下受损的肝细胞分泌携带肝特异性miR-122和外泌体相关白蛋白转录体mRNA(ALB mRNA)的外泌体,通过改变miR-155和高迁移率组盒的表达而激活炎症反应[28]。同时肝细胞来源的外泌体能通过DR5-ROCK1信号途径诱导IL-1β、IL-6 mRNAs的表达和分泌进而激活巨噬细胞，增加细胞因子的表达，导致肝损伤[29]。

4．外泌体与急性肾损伤：急性肾损伤也是SAP常见的并发症之一，SAP可致体液蓄积在第三间隙，使有效循环血量不足，同时激活肾素血管紧张素系统，加重肾血流动力学障碍。另外，SAP体内凝血及纤溶系统失衡，出现高凝状态，促使微循环血栓形成，加重肾缺血及缺血再灌注损伤。肾单位中的血管内皮细胞、肾小管上皮细胞、足细胞等都可以分泌外泌体，也可以在循环血、尿液等体液中检测到外泌体[30]。外泌体能通过影响近端小管-远端小管间的物质通讯、炎症反应的调节、水通道蛋白的表达[31]等诱发肾功能障碍。来源于肾小管上皮细胞的外泌体包含的炎症细胞因子，如趋化因子CCL2，能增加炎症反应及诱导巨噬细胞迁移[32]。缺血再灌注可使肾小管上皮细胞分泌含多种特异性miRNA的外泌体，加重肾损伤，如miR-21可促进IL-6和TNF-α等炎症因子的分泌，miR-24具有促凋亡效应等[33]。

三、外泌体作为SAP治疗靶点的展望

外泌体在细胞间通讯中起到重要作用，并且能够通过表面受体的相互作用和对蛋白、核酸等的传递来调节靶细胞的活性，对疾病起到延缓或加重的作用。急性肺损伤时，肺泡Ⅱ型上皮细胞可分泌含miR-371b-5p的外泌体，通过协调PTEN/PI3K/AKT信号途径，激活肺泡Ⅱ型上皮细胞的再生，促进损伤修复[34]。骨髓间充质分泌的外泌体能治疗由内毒素诱导的急性肺损伤[35]和急性肾损伤[36]。因此外泌体在个性化靶向治疗的研究领域具有无限的潜能。通过人诱导的多潜能干细胞来制备外泌体，采用电穿孔方法将沉默ICAM-1基因的siRNA导入到外泌体中，从而降低肺毛细血管内皮细胞(靶细胞)ICAM-1的表达，进而降低中性粒细胞与内皮细胞的黏附作用和炎症反应[37]。Alvarez-Erviti等[38]也阐述了基于外泌体的siRNA药物输送治疗阿尔茨海默症的方法，为胰性脑病致脑组织的损伤提供一定的治疗方式。

外泌体作为一类新兴的细胞间通讯和药物靶点设计仍有许多问题有待进一步研究。在关注其对机体有利的同时也应关注潜在的风险。在病毒性肝炎的研究中发现携带病毒RNA的外泌体能激活固有免疫反应起到保护作用，但同时又能使受感染的病毒RNA及其相应的物质免受抗体介导的免疫反应[39]。外泌体可协助肿瘤细胞与机体细胞的物质交换，从而促进肿瘤的生长和进展[40]。因此，需要进一步明确荷载内容物的性质和靶点，最大程度减轻风险。同时，外泌体包含以mRNA和微小RNA的基因形式，有助于肿瘤基因标志物的筛选和提供新的诊断和预后的信息。研究表明，外泌体miRNA在胰腺导管腺癌与慢性胰腺炎的鉴别诊断中更具敏感性和特异性[41]。

综上所述，外泌体在SAP所致的多器官功能障碍中的具体机制和信号途径涉及面很广，在不同细胞、组织、器官中的共性和特异性仍需深入研究。外泌体靶向机制及对靶器官基因调控机制有待进一步深入研究。是否可通过清除有害的外泌体或阻断外泌体的定位来阻断SIRS的进展仍需通过动物实验来论证。期待针对外泌体相关靶点的新药开展临床研究，为提高SAP的救治成功率提供依据。

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