牙龈间充质干细胞与牙周膜干细胞膜片牙周再生能力的实验研究*

2019-01-03邓蔡张丽历丹桂婷冷卫东

西部医学 2018年12期

邓蔡张丽历丹桂婷冷卫东

(湖北医药学院附属太和医院口腔医学中心牙周科，湖北十堰 442000)

牙周病是成人牙齿功能丧失的主要原因，同时还与部分系统性疾病有关，对口腔及全身健康均有较大的影响[1]。牙周组织生理性和功能性的完全再生是治疗此类疾病的最终目标，但由于牙周解剖结构的特殊性，目前还未出现完全有效的治疗方案[2-3]。基于干细胞技术的组织工程是牙周再生研究的新方向，目前首选种子细胞是牙周膜干细胞(periodontal ligament stemcells，PDLSCs)[4]，但其需要拔牙才能获得，应用受到限制。牙龈间充质干细胞(gingival mesenchymal stem cells，GMSCs)同为牙源性种子细胞，获得更为方便，本研究重点探讨GMSCs作为牙周再生种子细胞的可行性，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料细胞培养试剂：α-MEM培养基、胎牛血清FBS，均购自美国Hyclone；0.25%胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、二甲基亚砜 DMSO、维生素C-二磷酸盐、β-甘油磷酸钠、地塞米松、吲哚美辛，均购自美国Sigma；Dispase，购自美国Roche；L-谷氨酰胺，购自美国Gibco；青、链霉素(华北制药)。转染试剂：eFGP慢病毒载体，购自广州赛业生物科技；潮霉素，购自美国Sigma。膜片及模型制备试剂：EDTA凝胶、戊巴比妥钠、氯已定含漱液、阿替卡因肾上腺素注射液，均为国产；自制0.5%氯化血红素-维生素K1溶液、牛心脑浸液液体培养基、15%EDTA脱钙液。检测试剂：兔抗人多克隆GFP抗体，购自美国Cell signaling；免疫检测试剂盒、DAB显色试剂盒、DAPI染色液，购自北京中杉金桥生物；多聚赖氨酸粘片剂，购自美国Sigma；苏木素、伊红、二甲苯、无水乙醇等为国产分析纯。

1.2 实验仪器二氧化碳恒温培养箱，购自德国HERAcell；倒置相差摄像显微镜，购自德国leica；低速台式大容量离心机、台式高速离心机、分光光度计，均购自德国Eppendorf；流式细胞分析仪，购自美国Beckman；超低温冰箱，购自美国Thermo Forma；厌氧菌培养箱，购自英国RUSKINN；麦氏比浊仪，购自美国BD；漩涡振荡器，购自上海沪西分析仪器厂；全自动脱水机，购自英国SHANDON；偏振光显微镜，购自日本Olympus。

1.3 动物材料雄性比格犬4只，体重(9±1.7)kg，9～12月龄，由同济医学院动物实验中心提供。

1.4 实验方法

1.4.1 分离GMSCs和PDLSCs 征得患者同意后，采集牙周健康患者废弃的小块牙龈组织及健康前磨牙，原代培养GMSCs和PDLSCs，当细胞克隆生长达到培养瓶70%～80%后，以0.25%胰酶消化传代。当长梭形细胞胞质回缩为圆形时，终止消化。然后制备单细胞悬液。1：1传代，使细胞均匀铺于瓶底生长。当P1代细胞占瓶底的80%～90%后，再次将其制备为单细胞悬液，计数。随后将细胞悬液稀释至10个细胞/ml，接种到96孔板，100μl/孔，植入5%CO2、37℃孵育24h。于倒置显微镜下挑选并标记只含单个细胞的孔，加入培养液200μl培养。至30%～50%孔底面积被细胞铺满时，消化分离，获得具有自我更新能力的GMSCs和PDLSCs。

1.4.2 制备可稳定表达eGFP的GMSCs和PDLSCs 首先获得慢病毒转导最佳MOI值：制备P3代GMSCs和PDLSCs均匀细胞悬液，以103个/孔的细胞密度接种至96孔板，培养24h。采用无血清无双抗的α-MEM培养基将病毒梯度稀释至MOI分别为0、10、20、40、60、80、100、200，加入96孔板。在5%CO2、37℃饱和湿度下孵育。在荧光显微镜下持续观察细胞生长状况及绿色荧光蛋白表达情况，确定最佳MOI值。随后以最佳MOI再次转染细胞，转染8h后换用含10%FBS的新鲜α-MEM培养基，48h后换含有潮霉素的培养基筛选稳定表达eGFP的细胞。

1.4.3 制备GMSCs和PDLSCs膜片将能够稳定表达eGFP的P4代GMSCs和PDLSCs吹打为单细胞悬液，均匀接种至培养皿，在37℃、5%CO2条件下培养24h，细胞充分贴壁伸展后加入膜片诱导培养液。至倒置显微镜下课观察到底部边缘出现细胞褶皱后结束培养。

1.4.4 动物模型制备 4只雄性比格犬均选择双侧下颌第2、3、4前磨牙(P2、P3、P4)作为手术牙位制备模型。首先以我院临床中重度慢性牙周炎患者为取材对象，培养牙周来源的混合厌氧菌，培养至菌液浓度1.5×109CFU/ml后应用。随后手术暴露P2、P3、P4唇舌侧骨板，翻瓣后磨除根分叉区牙槽骨，制备冠根向约5mm缺损，磨除牙根处牙槽骨。蘸取混合菌液70μl，置于缺损内，缝合粘骨膜瓣。模型建立约2周后，可观察牙龈红肿，探诊出血，提示成功建立牙周炎Ⅲ度根分叉病变模型。开展牙龈基础治疗，并每日采用复方氯已定含漱液进行口腔卫生护理。

1.4.5 分组及膜片植入每只比格犬单侧3颗患牙分别采用植入GMSCs膜片(GMSCs组)、PDLSCs膜片(PDLSCs组)，或不植入膜片(空白对照组)。保证单侧3颗患牙处理方案不同、双侧同名牙处理方案不同。细胞膜片植入根分叉骨缺损区，术后3d给予5万单位/kg青霉素肌注，每天2次，每日继续应用复方氯已定含漱液，直至10天后拆线。拆线后每2～3天应用复方氯已定含漱液。

1.4.6 标本处理膜片植入8周后，处死比格犬，取出实验牙及周围组织，脱钙后将每颗牙齿以近远中方向自牙体中央切成颊侧、舌侧两部分，分别包埋、制备3μm厚切片备用。

1.5 观察项目

1.5.1 HE染色随机选取每个标本中的3张切片，经常规HE染色后光学显微镜下观察形态学改变，测量如下指标：缺损高度、新生牙骨质百分比、新生骨面积百分比。其中新生牙骨质百分比指根分叉区新生牙骨质长度占牙根的比例；新生骨面积百分比指新生小梁骨占根分叉区缺损总面积的百分比。

1.5.2 天狼星红染色随机选取每个标本中的3张切片，开展天狼星红-苦味酸试验，在偏光显微镜下观察新生牙周膜中的胶原纤维。评价标准：Ⅰ型，指胶原纤维紧密排布，双折光性强，纤维颜色呈黄色或红色；Ⅱ型指胶原纤维双折光性弱，排布呈疏松网状，颜色不固定；Ⅲ型指胶原纤维双折光性弱，呈绿色的细纤维；Ⅳ型指仅可见显示弱双折光的基膜，呈淡黄色。

1.5.3 免疫组化分析切片标本采用免疫组化二步法检测GFP在新生牙周组织中的分布情况。

2 结果

2.1 3组HE染色结果比较两种干细胞膜片植入后，根分叉区均有明显的牙槽骨和骨质再生，但新生牙骨质较薄，基质内含有丰富的牙骨质细胞。空白对照组牙槽骨和牙骨质再生较少。3组骨缺损高度比较差异无统计学意义(P>0.05)，PDLSCs组和GMSCs组新生牙骨质百分比、新生骨面积百分比均明显高于空白对照组，但PDLSCs组与GMSCs组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 HE染色结果分析Table 1 Analysis of HE staining resulfs

注：与空白对照组相比，①P<0.05

2.2 3组天狼星红染色结果比较 GMSCs组：新生牙周纤维粗大，多垂直插入新生牙骨质，具备Sharpey’s纤维特征，偏振光显微镜下牙周韧带纤维主要为Ⅰ型，见图1A；PDLSCs组：与GMSCs组基本一致，见图1B；空白对照组：新生牙周韧带主要水平向插入新生牙骨质，不具备Sharpey’s纤维特征，偏振光显微镜下牙周韧带纤维主要为Ⅰ型和Ⅲ型，见图1C。

图1 三组天狼星染色结果图Figure 1 Three sets of sirius staining results

注：A.高倍偏振光显微镜下，牙周再生韧带主要为橙色，且多以>60°方向插入新生牙骨质；B. 高倍偏振光显微镜下，牙周再生韧带主要为橙色，且多以>60°方向插入新生牙骨质；C. 高倍偏振光显微镜下，牙周再生韧带主要为橙色或绿色，且多以<60°方向插入新生牙骨质

2.3 3组免疫组化结果比较采用免疫组化分析检测再生组织中GFP红染骨细胞的表达，结果显示GMSCs组、PDLSCs组红染骨细胞占比接近，且均明显高于空白对照组(P<0.05)，见表2。

表2 3组免疫组化分析结果Table 2 3 sets of immunoassay resuts

注：与空白对照组相比，①P<0.05

3 讨论

PDLSCs是研究较广泛的牙周再生组织工程种子细胞，已有较多研究证实了其具备良好的牙周组织再生潜能。袁萍等[5]研究显示，PDLSCs可表达间充质干细胞表面标志物STRO-1和CD146，且来源于牙周炎患者的PDLSCs具备更强的增殖潜能，但其成骨分化能力下降；体外培养鼠PDLSCs具备良好的增殖活性和矿化能力，但性能差于根尖乳头干细胞[6-7]；安康康等[8]研究显示，PDLSCs具备良好的成骨和成脂分化能力。但该细胞来源有限，获取困难，并不适宜于临床大规模应用。

GMSCs同为牙周组织来源，其具备取材方便、易培养的优势，部分研究也证实其具备良好的成骨能力。研究显示GMSCs具备良好的成骨和成脂能力，且碱性成纤维细胞生长因子能够抑制其的成骨能力、促进其成脂能力[9-10]；陈岩等[11]研究显示GMSCs经诱导后具备矿化能力，且根端牙胚条件培养液能够诱导其分化。本研究结果与之一致，也观察到GMSCs膜片能够有效促进牙周组织再生。

为了有效对比观察2种膜片移植后在生物体内的增殖及分化情况，本研究对所移植细胞膜片进行了eGFP标记，再利用荧光显微镜能够有效观察到GMSCs和PDLSCs在体内的增殖和分化情况。2种细胞膜片组根分叉组织缺损区均有新生牙骨质、牙周膜和骨组织形成，而空白对照组几乎不能观察到上述新生组织。植入细胞膜片后，大部分新生牙槽骨在显微镜下呈橙色表达，这说明再生的牙周纤维主要为Ⅰ型，且天狼星红染色显示，可靠到多数胶原纤维垂直或接近垂直地插入新生牙骨质，而空白对照组牙周纤维束多与牙根面平行，并不具备正常功能，提示细胞膜片对新生牙周围韧带具有调节作用[12-14]。免疫组化结果显示，植入细胞膜片后，大部分新生的牙周组织来源于植入的可稳定表达GFP的干细胞，上述结论均提示GMSCs与PDLSCs一样，能够形成牙周膜、牙槽骨可牙骨质。但免疫组化结果也表明，并非所有的再生组织都能表达绿色荧光蛋白，这说明机体内源性前体细胞也参与修复了牙周缺损。由此可推测，GMSCs和PDLSCs具备2种促牙周组织再生能力，可直接分化为牙周组织，对宿主内源性前体细胞有间接调控途径。研究也证实PDLSCs能够激活机体Wnt信号通路，从而调控其他细胞的分化[15-18]。总之，GMSCs与PDLSCs细胞膜片均能够有效促进牙周再生，基于获得方便性上进行对比，采用GMSCs更具优势[19-20]，具备更广泛的应用空间。