半夏白术天麻汤≤1000Da小分子混合物含药血清指纹图谱研究

王淑玲，蔡梅超，扈金东，徐 男，门连汇，谢 恬

(1.杭州师范大学 医学院，浙江 杭州310036；2.浙江省榄香烯类抗癌中药研究重点实验室 浙江 杭州 310036；3.浙产中药材资源开发与应用浙江省工程实验室，浙江 杭州310036；4.山东中医药大学，山东 济南 250355；5.山东中医药研究院 国家中医药管理局中药分析重点学科，山东 济南250014)

半夏白术天麻汤为治疗高血压病的常用经典名方，对治疗高血压具有较好的临床价值[1-2]。该方剂中包括半夏(9 g)，白术(15 g)，天麻(6 g)，橘红(6 g)，茯苓(6 g)，甘草(4 g)六味中药。中药的化学成分是其发挥药效的物质基础，课题组前期分别采用半仿生提取法(semi-bionic extraction，SBE)、半仿生-酶法(semi-bionic-enzymatic extraction，SBEE)、水提法(water extraction，WE)、醇提法(alcohol extraction，AE)对半夏白术天麻汤进行了提取，并对不同方法提取物的HPLC指纹图谱进行了研究[3]。SBE法为口服给药的中药及其复方的一种提取技术，由张兆旺教授等首先提出[4-6]。SBEE法是基于SBE法，引入生物酶提取技术，仍然坚持“有成分论，不惟成分论，重在机体药效学反应”的理论体系，更坚持以单体、活性混合物，指纹图谱,血清指纹图谱及药效学等为考察指标。WE法即“煎煮法”，是将药材和水熬煮取汁的方法。AE法是采用乙醇进行提取的方法。中药有效成分大多为小分子物质，小分子物质吸收入血液发挥药物的直接或者间接作用[7-8]。本研究对4种不同提取方法的提取液中≤1000 Da小分子混合物进行含药血清指纹图谱研究，比较不同提取方法的半夏白术天麻汤小分子物质的吸收情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料 选用健康SD大鼠40 只，250±20 g，雄性，购自山东中医药大学实验动物中心。半夏、白术、天麻、橘红、茯苓、甘草购于陕西信瑞生物科技有限公司，色谱纯乙腈购自天津赛孚瑞科技有限公司，其他试剂均为分析纯。

1.2 实验仪器 Agilent1100高效液相色谱仪购于美国安捷伦公司，超滤(UF)/微滤(MF)设备购于杭州凯滤膜技术有限公司，MS105DU电子天平购于河北科创实验仪器销售有限公司。

1.3 小分子混合物样品液制备[9]将处方中药分别粉碎，按比例称取10～20 目的粗粉。①SBEE液的制备：方药粗粉用纤维素酶(以饮片质量计)预处理 24 h后提取3次，提取用水量依次为粗粉质量的10、8、8 倍；第1煎加入0.5 %胃蛋白酶，第3煎加入1 %胰蛋白酶(以提取用水体积计)；水的pH值依次为2.0、6.5、9.0；提取时间依次为90、60、60 min；提取温度为61±1 ℃；提取液依次粗滤后3500 r/min离心25 min后取上清。②SBE液的制备：方药粗粉提取3 次，提取用水量依次为粗粉质量的10、8、8 倍；水的pH值依次为 2.0、6.5、8.5；提取时间依次为120、90、90 min；提取液依次粗滤后3500 r/min离心25 min后取上清。③WE 液的制备：方药粗粉提取 3 次，提取用水量依次为粗粉质量的10、8、8 倍；提取时间依次为120、90、90 min，提取液依次粗滤后3500 r/min离心25 min后取上清。④AE液的制备：方药粗粉用80%乙醇提取3次，提取用醇量依次为粗粉质量的10、8、8 倍；提取时间依次为1、0.5、0.5 h；提取液依次粗滤后3500 r/min离心25 min后取上清。4种方法的提取液再分别用超滤/微滤(UF/MF)设备选取一定规格的中空纤维膜，按照分子量的大小依次过滤，合并浓缩至2.83 g/mL，即得≤1000 Da小分子混合物SBEE样品液(简称SBEE液)、≤1000 Da小分子混合物SBE样品液(简称SBE液)、≤1000 Da小分子混合物WE样品液(简称WE液)、≤1000 Da小分子混合物AE样品液(简称AE液)。

1.4 含药血清样品制备 将大鼠随机分为空白对照组和给药组，每天灌胃2次，连续灌胃3 d，给药组以3.0 g/kg剂量分别灌胃4种小分子混合物样品液，空白对照组灌胃等质量的生理盐水。分别于灌胃后2 h采用10%水合氯醛溶液腹腔麻醉大鼠，肝门静脉取血5 mL，待血液凝固后3500 r/min离心20 min取上清液2 mL，分别加4倍体积的甲醇，涡旋混匀5 min，3500 r/min离心20 min取上清液，40 ℃水浴氮气吹干。沉淀加0.5 mL甲醇溶解，3500 r/min离心20 min取上清液，即得4种提取方法的≤1000 Da小分子混合物含药血清样品，分别简称为SBEE液含药血清样品、SBE液含药血清样品、WE液含药血清样品、AE液含药血清样品。

1.5 含药血清样品指纹图谱绘制 采用Agilent1100高效液相色谱仪，DiamonsilTMC18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)，色谱条件：流动相为乙腈(A)-水(B)；线性梯度洗脱时间为0min→45 min(A%：5%→45%)，45 min→60 min(A%：45%→100%)，60min→65min(A%：100%)；流速为1.0 mL/min；检测波长为280 nm；参比波长为400 nm；进样量20 μL。

1.6 含药血清指纹图谱检测指标 根据共有峰的重叠率公式(1)分别计算SBEE液、SBE液、WE液、AE液含药血清指纹图谱共有峰的重叠率。根据公式(2)、(3)，计算SBEE液含药血清指纹图谱与其他3种提取液含药血清指纹图谱之间的差异率和总差异率。以SBEE液含药血清指纹图谱为标准图谱，利用相关系数、夹角余弦值与欧氏距离测度方法，按公式(4)、(5)、(6)，分别计算不同方法提取液含药血清指纹图谱的相似度。

式中：a为共有峰；x为SBEE液、SBE液、WE液、AE液峰数；c为SBEE液峰数。

式中：Aj为待测供试液中某个特征峰的面积；Ai为SBEE供试液中某个特征峰的面积；n为特征指纹峰的总数。

2 结果

2.1 ≤1000 Da小分子混合物含药血清指纹图谱 SBEE、SBE、AE、WE液含药血清指纹图谱见图1，选取含药血清指纹图谱中一个共有的、峰面积较大、分离度大于1.50的色谱峰为内参照峰(保留时间为42.196 min)。SBEE液、SBE液、WE液、AE液含药血清指纹图谱中分别有19、16、16、17个特征峰，其中SBE液、WE液、AE液含药血清指纹图谱的特征峰均在SBEE液含药血清指纹图谱中出现。4种方法提取液≤1000 Da小分子混合物含药血清HPLC指纹图谱特征峰总面积大小依次为：SBEE(3995.2 mAU/min)>SBE(3589.4 mAU/min)>AE(3394.0 mAU/min)>WE(2092.0 mAU/min)。

A. SBEE液含药血清样品；B. SBE液含药血清样品；C.WE液含药血清样品；D. AE液含药血清样品。图1 4种方法提取液≤1000 Da小分子混合物含药血清HPLC色谱图(2 h)

2.2 含药血清指纹图谱共有峰重叠率比较 选择峰总面积最大、特征峰数最多的SBEE液含药血清指纹图谱为标准图谱，根据共有峰的重叠率公式(1)分别计算SBEE液与SBE液、WE液、AE液含药血清指纹图谱共有峰的重叠率，AE液与SBEE液含药血清指纹峰重叠率(89.47%)最高，SBE液(84.21%)、WE液(84.21%)与SBEE液含药血清指纹峰重叠率次之。

2.3 强峰峰面积差异率和总差异率比较 峰号为3、4、8、10、12、14、15、16、17、18、19的特征峰峰面积较大，SBEE液含药血清指纹图谱特征峰面积与其他3种提取液含药血清指纹图谱之间的总差异率大小依次为：WE(5.7198%)>AE(5.6975%)>SBE(4.9289%)，见表1。

表1 含药血清指纹图谱强峰峰面积差异率

2.4 含药血清指纹图谱相似度比较 以SBEE液含药血清指纹图谱为标准，利用相关系数、夹角余弦值与欧氏距离测度方法，按公式(4)、(5)、(6)，分别计算不同方法提取液含药血清指纹图谱的相似度，SBEE液含药血清指纹图谱与其他3种之间的差别大小依次为：WE>AE>SBE，见表2。

表2 含药血清指纹图谱相似度比较

3 讨论

在进行采血时间优选预实验中，给药2 h后采血的指纹图谱出现的色谱峰数最多，总面积最大，故本研究的给药后采血时间确定为2 h。在进行血清沉淀剂优选预实验中，与乙腈比较，甲醇沉淀后内源性杂质少，故确定甲醇为本研究采用的沉淀剂；结果同时显示4倍体积量甲醇可除去大部分杂质，故确定甲醇的用量为全血体积量的4倍。

本研究对半夏白术天麻汤4种方法提取液(SBEE液、SBE液、WE液、AE液)≤1000 Da小分子混合物的含药血清HPLC指纹图谱进行了系统研究。结果显示：SBEE液含药血清指纹图谱有19个特征指纹峰，SBE液含药血清少3个特征指纹峰(8、14、15)，WE液含药血清少3个特征指纹峰(8、11、15)；AE液含药血清少2个特征指纹峰(5、14)。SBE液、WE液、AE液各个含药血清指纹图谱特征峰总面积与SBEE液的含药血清指纹图谱特征峰总面积比值分别为0.8984、0.5236、0.8495。峰总面积大小顺序为SBEE>SBE>AE>WE，说明SBEE法更有利于机体吸收该方提取液中的成分。用相关系数、夹角余弦测度与欧氏距离测度方法检测4种方法提取液含药血清指纹图谱相似度，本研究结果显示，3种测度结果一致，SBE液与SBEE液所含成分最相近，且SBE液提取率仅次于SBEE液。

综上所述，与SBE法、AE法、WE法比较，SBEE法提取液的含药血清指纹图谱的特征峰最多，总峰面积最大，SBEE法更有利于机体吸收半夏白术天麻汤提取液中的成分。