有髯鸢尾种质离体保存研究

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(1.河北省林业科学研究院，河北 石家庄 050061； 2.河北省林木良种工程技术研究中心，河北 石家庄 050061； 3.天津创世生态景观建设股份有限公司，天津 300000； 4.河北农业大学，河北 保定 071000)

种质资源又称遗传资源，是物种进化、遗传学研究及植物育种的物质基础[1]。离体保存法作为植物种质资源圃活体保存替代技术，是保证植物种质资源遗传多样性的一种新兴途径[2-3]，可以有效延长组培苗继代周期，避免频繁继代，节约培养成本，并且使材料一直处于生长状态，保持种质优良特性。相关研究[4-7]表明，甘露醇、山梨醇等高渗保透剂以及CCC、ABA、PP333等植物生长延缓剂可以有效抑制植物组培苗的高生长，使组培苗节间缩短，并矮化、壮化植株，已经在南天竹[8]、马铃薯[5]、茶树[9]等植物的研究上取得了较有价值的研究成果。

有髯鸢尾(BeardedIris)，为鸢尾科(Iridaceae)鸢尾属(Iris)多年生草本植物，是垂瓣上有髯毛附属物的鸢尾品种的统称[10-11]。目前，全世界有髯鸢尾已超过2万余种[12]，花色包括了除正红色以外所有的颜色，有髯鸢尾不同的花色组合不仅可以美化、香化环境，还能形成良好的园林绿化景观。在现阶段，有髯鸢尾种质资源主要依靠活体保存[13]，而活体保存需要现代设施条件，保存成本较高，且易受病虫害等的影响而造成珍贵品种资源的流失。此外，在生产过程中，有髯鸢尾组织培养诱导成苗需4～6个月的时间[14-16]，且外植体花蕾的采集受花期限制，不可避免出现频繁继代培养，造成人力物力浪费以及可能发生变异等问题。因此，为克服传统活体保存方法的缺点，解决组织培养产业化生产中出现的问题，开展有髯鸢尾种质资源离体保存研究迫在眉睫。鉴于此，选用PP333、B9、CCC、ABA、甘露醇、山梨醇6种药剂，对有髯鸢尾的离体保存方法进行了初步研究，以期为有髯鸢尾的种质离体保存优化、组培产业化以及种质创新提供数据支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料

选择稳定、正常生长的有髯鸢尾1A(印度首领×白与蓝)继代5次组培苗为试验材料，在河北省林业科学研究院组培实验室进行有髯鸢尾种质离体保存研究。

1.2 试验方法

采用单因素试验设计，以MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA为基本培养基，分别添加不同质量浓度的PP333、B9、CCC、ABA、甘露醇、山梨醇，每种药剂的质量浓度梯度见表1。对照(CK)不添加药剂。培养基中琼脂为6.5 g/L，蔗糖为30.0 g/L，pH值为5.8～6.0，采用塑料封口膜封口，高压灭菌。灭菌温度为121 ℃，灭菌时间为18 min。将有髯鸢尾1A组培苗以芽间剥离的方式分成3株/丛，接种到培养基中，每处理接种15瓶，每瓶接种3丛。每处理重复3次。培养室中温度为23～25 ℃，光照强度为1 000～1 500 lx，光照时数为12 h/d(每日的6：00—18：00为光照时间)。

表1 有髯鸢尾1A组培苗种质离体保存不同药剂质量浓度设置

注：P、B、C、A、G、S分别代表PP333、B9、CCC、ABA、甘露醇、山梨醇。

1.3 测定指标与方法

接种完成后，随时观察、记录组培苗的生长状况。接种120 d时统计存活率、黄叶率、增殖倍数、株高。其中，株高为株丛基部到顶部之间的距离(不包括根茎)。

存活率=存活株数/接种株数×100%；

黄叶率=黄叶株数/接种株数×100%；

增殖倍数=增殖后芽数/起始芽数。

1.4 数据处理

数据用Excel进行表格记录与数据运算，用DPSv 7.05进行差异显著性检验。用隶属函数法综合评价不同处理的离体保存效果，对存活率、黄叶率、增殖倍数、株高的隶属值进行累加，求取平均值。

X(u)= (X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中，X(u)为各指标隶属函数值累加后求取的平均值。X为某一处理的某一指标的测定值，Xmax为所有处理在该指标中的最大值，Xmin为所有处理在该指标中的最小值。隶属函数值平均值越大，组培苗生长越好，离体保存效果也越好[17]。

2 结果与分析

2.1 PP333对有髯鸢尾1A组培苗生长的影响

由表2可以看出，添加不同质量浓度的PP333对有髯鸢尾1A组培苗的生长影响明显，存活率、黄叶率、增殖倍数、株高4个指标部分处理间差异达到显著或极显著水平。接种120 d时，P1—P5处理组培苗存活率均为100%，CK组培苗全部死亡。可见，不同质量浓度PP333均对有髯鸢尾1A组培苗的生长起到较强的抑制作用。随着PP333质量浓度的增加，株丛黄叶率、株高均呈现明显下降趋势，而增殖倍数则表现为先上升后下降的趋势。综合考虑抑制效果及株丛生长状况，P4即PP3338.0 mg/L的处理，较有利于有髯鸢尾1A组培苗120 d的保存，其株丛存活率为100%，无黄叶现象，增殖倍数为3.1，株高为6.8 cm。PP333质量浓度过高会对组培苗产生毒害作用。另外，P4处理有少量生根现象，这可能与适宜浓度的PP333能促进鸢尾组培苗的生根生长有关。

表2 不同质量浓度PP333对有髯鸢尾1A组培苗生长的影响

注：不同大、小写字母表示在0.01、0.05水平差异，下同。

2.2 B9对有髯鸢尾1A组培苗生长的影响

由表3可以看出，添加不同质量浓度的B9对有髯鸢尾1A组培苗的生长影响明显，存活率、黄叶率、增殖倍数、株高4个指标部分处理间差异分别达到显著或极显著水平。接种120 d时，B1—B5处理组培苗存活率均为100%，CK组培苗全部死亡。可见，不同质量浓度B9均对有髯鸢尾1A组培苗的生长起到较强的抑制作用。随着B9质量浓度的增加，株丛黄叶率、株高均呈现出明显下降趋势，而增殖倍数则是先上升后下降。综合考虑抑制效果及株丛生长状况，B5即B915.0 mg/L的处理，较有利于有髯鸢尾1A组培苗120 d的保存，其株丛存活率为100%，黄叶率为50.0%，增殖倍数为2.9，株高为 4.9 cm。

表3 不同质量浓度B9对有髯鸢尾1A组培苗生长的影响

2.3 CCC对有髯鸢尾1A组培苗生长的影响

由表4可以看出，添加不同浓度的CCC对有髯鸢尾1A组培苗的生长影响明显，存活率、黄叶率、增殖倍数、株高4个指标部分处理间差异分别达到显著或极显著水平。接种120 d时，C1—C5处理组培苗存活率均在75.0%以上，CK组培苗全部死亡。可见，不同质量浓度CCC均对有髯鸢尾1A组培苗的生长起到较强的抑制作用。随CCC质量浓度的增加，株丛存活率逐渐升高，黄叶率依次降低，增殖倍数、株高均呈现出先上升后下降的趋势。综合考虑抑制效果及株丛生长状况，C5即CCC 40.0 mg/L的处理，较有利于有髯鸢尾1A组培苗120 d的保存，其株丛存活率为100%，无黄叶现象，增殖倍数为3.4，株高为5.8 cm。

表4 不同质量浓度CCC对有髯鸢尾1A组培苗生长的影响

2.4 ABA对有髯鸢尾1A组培苗生长的影响

由表5可以看出，添加不同质量浓度的ABA对有髯鸢尾1A组培苗的生长影响明显，存活率、黄叶率、增殖倍数、株高4个指标部分处理间差异分别达到显著或极显著水平。接种120 d时，A1—A5处理组培苗存活率均在66.8%以上，CK组培苗全部死亡。可见，不同质量浓度ABA均对有髯鸢尾1A组培苗的生长起到较强的抑制作用。随着ABA质量浓度的增加，株丛存活率、增殖倍数、株高均呈现明显下降趋势，而株丛黄叶率则表现为先降低后上升的趋势。综合考虑抑制效果及株丛生长状况，A3即ABA 4.0 mg/L的处理，较有利于有髯鸢尾1A组培苗120 d的保存，其株丛存活率为91.8%，黄叶率为13.2%，增殖倍数为2.5，株高为3.4 cm。ABA添加浓度过高，对株丛生长的抑制作用过大，反而会产生毒害作用，严重影响株丛的正常生长与增殖。

表5 不同质量浓度ABA对有髯鸢尾1A组培苗生长的影响

2.5 甘露醇对有髯鸢尾1A组培苗生长的影响

由表6可以看出，添加不同质量浓度的甘露醇对有髯鸢尾1A组培苗的生长影响明显，存活率、黄叶率、增殖倍数、株高4个指标部分处理间差异分别达到显著或极显著水平。接种120 d时，G1—G4处理组培苗存活率均为100%，CK组培苗全部死亡。可见，不同质量浓度甘露醇均对有髯鸢尾1A组培苗的生长起到较强的抑制作用。随着甘露醇质量浓度的增加，株丛黄叶率、株高均呈现明显的下降趋势，而增殖倍数则表现为先上升后下降的趋势。综合考虑抑制效果及株丛生长状况，G4即甘露醇40.0 g/L的处理，较有利于有髯鸢尾1A组培苗120 d的保存，其株丛存活率为100%，无黄叶现象，增殖倍数为2.9，株高为2.6 cm。

表6 不同质量浓度甘露醇对有髯鸢尾1A组培苗生长的影响

2.6 山梨醇对有髯鸢尾1A组培苗生长的影响

由表7可以看出，添加不同质量浓度的山梨醇对有髯鸢尾1A组培苗的生长影响明显，存活率、黄叶率、增殖倍数、株高4个指标部分处理间差异分别达到显著或极显著水平。接种120 d时，S1—S4处理组培苗存活率均为100%，CK组培苗全部死亡。可见，不同质量浓度山梨醇均对有髯鸢尾1A组培苗的生长起到较强的抑制作用。随着山梨醇质量浓度的增加，增殖倍数、株高均呈现明显的下降趋势，而株丛黄叶率则表现为先上升后下降的趋势。综合考虑抑制效果及株丛生长状况，S3即山梨醇30.0 g/L的处理，较有利于有髯鸢尾1A组培苗120 d的保存，其株丛存活率为100%，无黄叶现象，增殖倍数为2.2，株高为4.4 cm。山梨醇添加浓度过高，对株丛生长的抑制作用过大，反而会产生毒害作用，严重影响株丛的生长与增殖。

表7 不同质量浓度山梨醇对有髯鸢尾1A组培苗生长的影响

2.7 有髯鸢尾1A组培苗离体保存处理综合评价

由表1—7可知，存活率、黄叶率、增殖倍数、株高4个指标的最优处理并不相同，因此，对4个指标进行了隶属函数评价。由综合评价结果(表8)可知，G4处理的综合评价值最高，达到81.87；其次是G3处理，综合评价值为81.66；再次是S3处理，综合评价值为81.44；P5、C5、P4、C4 4个处理的综合评价值也均在80以上，组培苗生长状况均良好。而A5处理综合评价值最低，仅为37.06，组培苗株丛受害严重。综上可知，有髯鸢尾有髯鸢尾1A组培苗的种质离体保存最佳处理为G4，组培苗接种120 d时，株丛存活率为100%，无黄叶现象，增殖倍数为2.9，株高为2.6 cm。

表8 有髯鸢尾1A组培苗离体保存处理综合评价

3 结论与讨论

常规组织培养条件下，有髯鸢尾的最佳继代周期约为30 d。当继代周期>30 d时，会导致株丛出现叶片黄化、腐烂、衰老，乃至死亡，不利于下一代的增殖培养。相关研究表明，甘露醇与山梨醇是同分异构体，属于惰性物质，不易被外植体吸收，可以提高培养基的渗透压，抑制植物细胞吸水，延缓植株生长[18]；CCC是一种季铵盐类植物生长调节剂，具有矮化植株的作用[8]；ABA具有抗赤霉素的作用，降低RNA聚合酶的活性，抑制DNA的合成，从而抑制材料的生长[19]；B9是一种高效低毒的植物生长延缓剂，可抑制茎端下部区域的细胞分裂和伸长生长[5]；PP333是植物生长延缓剂[6]，可抑制赤霉素的生物合成，使植株节间缩短，株型紧凑，矮小健壮。本研究发现，添加不同质量浓度的PP333、B9、CCC、ABA、甘露醇、山梨醇均能有效抑制有髯鸢尾1A组培苗的生长，株丛保存培养120 d仍生长正常，不需要转接继代，极大地延长了继代周期。可见，使用PP333、B9、CCC、ABA、甘露醇、山梨醇6种药剂进行有髯鸢尾的种质离体保存均具有较高的可行性。

利用隶属函数法进行试验结果的综合评价，已经广泛应用到植物抗性、生理、繁殖等[20-23]研究中，并得到大多数学者和专家的认可。综合考虑有髯鸢尾1A组培苗培养120 d的抑制效果及株丛生长状况，PP333、B9、CCC、ABA和甘露醇、山梨醇最适质量浓度分别为8.0、15.0、40.0、4.0 mg/L和40.0、30.0 g/L。本研究条件下，ABA、山梨醇质量浓度过高时，对株丛生长的抑制作用过大，严重影响株丛的生长与增殖，表明药剂添加浓度过高，反而会产生毒害作用。这与在文心兰[2]、草莓[7]、香果树[24]、葡萄[25]等植物上的离体保存研究结果相似。

另外，PP3338.0 mg/L处理中组培苗出现少量生根现象，这可能与适宜浓度的PP333能促进鸢尾组培苗的生根生长有关。可见，添加PP333后，组培苗株高被抑制，反而促进了根系的生长，但组培苗生根现象是否会影响种质保存的时间，以及是否会引发植株变异，还需进一步研究。

综合存活率、黄叶率、增殖倍数、株高及隶属函数评价结果，有髯鸢尾1A组培苗的种质离体保存最佳处理为G4，即甘露醇40.0 g/L的处理，组培苗接种120 d时，株丛存活率为100%，无黄叶现象，增殖倍数为2.9，株高为2.6 cm。

另外，鸢尾离体种质保存在鸢尾种质资源研究中尚属首例，本研究仅对有髯鸢尾1A组培苗接种120 d的离体保存效果进行了探索，后续将在更长时间的种质保存与恢复方面进行深入研究。