微生物发酵玉米蛋白粉生产富肽饲料的研究

■刘 骥 易春霞 韩业东 王 燕*

（1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江齐齐哈尔161006；2.东北农业大学动物科技学院，黑龙江哈尔滨150030；3.辽宁省畜产品安全监察所，辽宁沈阳110030）

我国蛋白饲料短缺现象严重，亟需开发新型富有 营养的蛋白饲料，因此微生物发酵改性玉米蛋白粉前景非常可观[1]。玉米可溶性蛋白包括玉米醇溶蛋白、玉米黄色素、玉米抗氧化肽、玉米降压肽、高F值寡肽和玉米蛋白活性肽等[2]，提高其可溶性蛋白含量，可以增加其功能性。郑喜群等用碱性蛋白酶和米曲霉固态发酵所产生的羧肽酶分别水解玉米醇溶蛋白，制备高F值寡肽[3]。秦旭东等在配合饲料中添加50%提取醇溶蛋白后的玉米蛋白粉饲喂生长猪，试验组较对照组体重增长的多[4]。吴泽柱采用枯草芽孢杆菌发酵玉米蛋白粉，发酵产生的蛋白酶使玉米蛋白粉的水解度显著提高[5]。

近年来，对水解蛋白的功能性进行了大量研究，许多研究表明，酶解玉米蛋白粉具有抗氧化活性肽。抗氧化活性肽可以清除体内多余的自由基，自由基本身是无害的电子，是体内正常代谢的产物。但是如果体内抗氧化系统不能代谢多余的自由基，就会产生氧化应激，损伤细胞和产生疾病，例如腹泻等。当发生仔猪腹泻时，一般我们采用抗生素来治疗疾病，但是抗生素的添加会在畜产品中残留，易引起食品安全隐患。添加抗氧化肽可以减少疾病的发生，减少抗生素的添加。

玉米蛋白粉特殊的氨基酸序列使其具有产生抗氧化肽的潜力。本文采用酵母菌发酵玉米蛋白粉，寻找最佳的发酵工艺，提高其溶解性和利用率，并测定其抗氧化活性，确定其功能性。

1 材料和方法

1.1 培养基配制及菌种培养

采用产朊假丝酵母进行发酵，采用PDA培养基进行菌种的活化和种子培养基培养。

1.2 试验方法

1.2.1 单因素试验

本文采用酵母菌发酵玉米蛋白粉，以可溶性蛋白为指标，优化工艺条件，寻找最佳的发酵工艺。

①料液比条件的确定

初始条件：玉米胚芽饼、玉米黄粉、玉米DDGS和麸皮按2∶1∶1∶1的固料比例加入到250 ml锥形瓶中，固料和水共50 g/250 ml锥形瓶，外加营养成分尿素、硫酸铵、糖蜜各0.5 g/250 ml锥形瓶。接菌量为6%、发酵时间为96 h、发酵温度为33℃。设置料液比梯度为：1∶0.8，1∶1，1∶1.25，1∶1.4，1∶1.6。每组三个平行实验。

②接种量条件的确定

条件同上。设置接菌量梯度为：2%、4%、6%、8%、10%。每组3个平行实验。

③发酵时间条件的确定

条件同上。设置发酵时间梯度为：48、72、96、120、144 h。每组3个平行实验。

④发酵温度条件的确定

条件同上。设置发酵温度梯度为：29、31、33、35、37℃。每组3个平行实验。

1.2.2 正交试验

在单因素试验确定的各因素的最佳工艺参数范围的基础上以L9（34）因素水平表，进行测定。

1.2.3 评价指标

可溶性蛋白含量采用福林酚法[6]。

1.2.4 发酵后玉米蛋白粉的蛋白的分子量分布

SDS凝胶电泳的操作方法参照刘成江等[7]的方法。

1.2.5 抗氧化性的测定

参照Zhang等[8]的方法，准确称取肽，用蒸馏水分别配制成0.5、1、1.5、2、4、6 mg/ml和8 mg/ml的样品溶液。取1 ml样品溶液加入试管中，加入0.1 ml 2 mM FeCl2溶液，混匀后加入3.7 ml双蒸水，然后加入0.2 ml 5 mM菲啰嗪溶液，震荡摇匀，反应混合物在室温下放置10 min，在562 nm处测吸光值，以双蒸水代替样品作空白对照。

式中：AS——加样品时在562 nm处测吸光值；

AC——加双蒸水时在562 nm处测吸光值。

2 结果与分析

2.1 料液比条件的确定

图1 料液比对产阮假丝酵母菌发酵物中可溶性蛋白含量的影响

由图1可以看出，当料液比为1∶1时，产阮假丝酵母菌发酵后的产物的可溶性蛋白含量最高，可达到75.34 mg/g。

2.2 接种量条件的确定

由图2可见，当接种量为8%时，产阮假丝酵母菌发酵后的产物的可溶性蛋白含量最高，可达到88.45 mg/g。

2.3 发酵时间的优化

由图3可以看出，当发酵时间为120 h时，产阮假丝酵母菌发酵后的产物的可溶性蛋白含量最高，可达到91.56 mg/g。

2.4 发酵温度的优化

由图4可以看出，当发酵温度为35℃时，产阮假丝酵母菌发酵后的产物的可溶性蛋白含量最高，可达到109.01 mg/g。

图2 接种量对产阮假丝酵母菌发酵物中可溶性蛋白含量的影响

图3 发酵时间对产阮假丝酵母菌发酵物中可溶性蛋白含量的影响

图4 发酵温度对产阮假丝酵母菌发酵物中可溶性蛋白含量的影响

2.5 正交试验数据及分析

在单因素试验结果的基础上选择对单因素条件影响较大的因素（料液比、接种量和发酵时间）设计正交水平试验，对各因素组合进行优化。正交试验设计及结果如表1所示。

表1 L9（34）正交试验水平

由表2中极差分析可知，可溶性蛋白含量测定时，RA＞RB＞RC，即在正交试验的3个因素中料液比的影响最大，其次是接种量和发酵时间。

表2 产朊假丝酵母菌发酵工艺优化试验结果

通过可溶性蛋白含量各水平的和（K1、K2、K3）可知，K1＞K2＞K3，说明料液比1水平为最佳；不同水平接种量的可溶性蛋白的和为K1＞K2＞K3，说明1水平最佳；不同水平的发酵时间的可溶性蛋白的和K2＞K1＞K3，说明2水平最佳。通过正交试验的显著性检验表3可知，该模型的拟合度是0.984，且模型是显著的，说明该正交试验的数据真实有效。通过正交试验，综合得出最佳组合为：料液比1∶1.5，发酵时间120 h，接种量15%。通过试验验证得到正交最高可溶性蛋白是95.33 mg/ml。

表3 正交试验的显著性检验

2.6 发酵前后蛋白分子量的分布

通过图5可以看出，经过酵母菌发酵后的蛋白质的分子量明显减少，超过31 000 Da的蛋白明显减少，而小于31 000 Da的蛋白明显增加，说明发酵使蛋白的分子量降低，使一些不溶的大分子肽转变成可溶的小分子肽。

图5 蛋白质电泳图

2.7 抗氧化活性测定结果

Fe2+与Fenton试剂反应产生羟基自由基，能够缩短链反应引发期的时间，且加快脂类化合物过氧化的反应速度。因此，当物质与金属离子发生螯合作用后，就可以减弱金属离子促进脂肪过氧化作用，间接地发挥了抗氧化的效果。

图6 玉米肽和乙二胺四乙酸同Fe2+的螯合能力

如图6所示，与EDTA相比，玉米肽展示一个低的铁离子螯合能力，这与Chen(1998)报道是一致的。Fe2+的清除能力与浓度呈强相关性，当玉米肽1 mg/ml时，螯合能力10%，而当玉米肽浓度为8 mg/ml时，螯合能力可达76.4%，与90 μg/ml EDTA螯合能力相当。Fe2+清除能力很可能依赖于氨基酸的组成和氨基酸的序列。

3 结论

通过产朊假丝酵母发酵玉米蛋白粉，极大地提高了玉米蛋白的可溶性，并测出其分子量降低且具有抗氧化活性肽的产生，理论上可以应用于乳仔猪饲料中应对氧化应激，减少抗生素的使用。